Novas alternativas terapêuticas para o tratamento da Criptococose: análogos de Resveratrol e microRNAs - Gullo, Fernanda Patrícia [UNESP] (2016)
Criptococose é uma importante micose sistêmica que acomete principalmente pacientes imunocomprometidos e é classificada como a infecção fúngica com maior mortalidade entre indivíduos portadores de HIV. Cryptococcus neoformans é uma levedura capsulada e o principal agente etiológico da criptococose; encontra-se dispersa no meio ambiente na forma de basidiósporos, os quais são responsáveis pela infecção em humanos e animais. As principais manifestações clínicas estão associadas à infecção pulmonar e meningite. A terapia se dá basicamente com a administração de anfotericina B (AMB) na terapia de ataque associada ou não a 5-fluocitosina e como manutenção é indicado ao longo do tratamento o fluconazol (FCZ). Apesar de esta terapêutica ser eficiente, é constatado elevado número de casos de reincidência e desenvolvimento de resistência aos azóis, além de problemas de toxicidade. Diante desta problemática, este estudo propõe o desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas para o tratamento da criptococose, visando duas abordagens distintas. A primeira, aplicando novo composto antifúngico e a segunda, o estudo de microRNAs (miRNAs) envolvidos na interação da levedura e células de glioblastoma humano (U87-MG), com a finalidade de usá-los como reguladores da infecção, sendo esta uma estratégia recentemente divulgada em uma variedade de doenças. Para tanto, inicialmente moléculas análogas de resveratrol foram avaliadas quanto a atividade antifúngica e o derivado orto,orto-HDZ (HDZ) mostrou forte atividade fungicida contra isolados de C. neoformans, com valores de concentração fungicida mínima (CFM) variando entre 0,97 a 7,81 µg/mL. A associação entre HDZ e FCZ mostrou sinergia com potencialização do efeito do FCZ em até 64 vezes para um isolado clínico resistente. Baixa toxicidade foi observada em ensaios in vitro e in vivo (Galleria mellonella e camundongos), apesar de mostrar alterações em embriões de Zebrafish. Além disso, este estudo mostrou a capacidade da associação HDZ + FCZ em inibir a interação da levedura e células hospedeiras (pneumócitos, macrófagos e glioblastoma) por citometria de fluxo e imunofluorescência. Ensaios in vivo (modelo murino) da atividade antifúngica de HDZ em combinação com FCZ mostrou que após 15 dias de tratamento houve redução significativa das unidades formadoras de colônias (UFC) no fígado, baço, cérebro, pulmões e lavado broncoalveolar, assim como o aumento da sobrevida dos animais em 198 dias e redução da morbidade, a qual foi avaliada por ensaio de comportamento (SHIRPA). Diante da segunda proposta deste trabalho, foram encontrados 10 miRNAs super-expressos na interação de C. neoformans e células U87-MG e foi observado que os miRNAs regulam principalmente vias de sinalização TGF-β, MAP quinase (MAPK) e interação receptor e matriz extracelular (MEC). Tais dados foram cruzados com transcritos que mostraram diferencialmente expressos na interação fungo-célula e as proteínas GTPase-3 e COP-1 foram selecionadas como importantes nesse processo. Tais proteínas estão associadas à via Rho-GTPase a qual é primordial para a ligação da levedura em células hospedeiras e mostrou aumento da expressão na infecção, assim como ligeira redução após o tratamento com HDZ. A indução da apoptose de células de glioblastoma por C. neoformans, foi observada através da técnica TUNEL e da expressão da proteína pró-apoptótica Bak e o tratamento com HDZ foi capaz de reverter esse processo. Nossos resultados indicam HDZ como uma interessante molécula para avançar nos estudos de desenvolvimento de um protótipo antifúngico contra C. neoformans e a inibição da expressão dos miRNAs durante a interação fungo-célula, pode ser interessante para controle da infecção fúngica, pois acreditamos que uma vez inibidos, podem reduzir a invasão da levedura em células hospedeiras, sendo então os miRNAs interessantes novos alvos terapêuticos e que o tratamento com HDZ são promissores para o desenvolvimento de um novo antifúngico.