Peptídeos sintéticos no estudo do sistema toxina-antitoxina ParE/ParD - Benites, Thais Azevedo [UNESP] (2017)
O sistema ParE-ParD é um sistema Toxina-Antitoxina (TA) do tipo II (composto por duas proteínas) encontrado no plasmídeo RK2 de uma gama de bactérias. A antitoxina ParD (9kDa) é capaz de neutralizar a citotoxicidade da toxina ParE, pela formação de um complexo estável, e também é eficaz na auto-repressão do operon parDE. A toxina (12kDa) apresenta atividade citotóxica no processo de replicação do DNA por interferir diretamente na ação da DNA girase. Estudos prévios sugeriram que a região C-terminal da antitoxina é responsável pelo processo de interação com ParE. Embora esta toxina possa ser encontrada em um grande número de microrganismos, ainda apresenta mecanismos de citotoxicidade e funções celulares a serem elucidadas. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo a tentativa de expressão das duas proteínas ParE e ParD, bem como o design e a síntese de peptídeos análogos da antitoxina, para a realização de estudos de interação molecular, a fim de encontrar uma estrutura mínima de ParD capaz de inativar a função toxica de ParE. Com base nas informações estruturais, obtidas por modelagem e dinâmica molecular, quatro sequências peptídicas análogas de ParD foram projetadas e sintetizadas pela metodologia da fase sólida. As sequências foram analisadas e purificadas por cromatografia líquida de alta eficiência e caracterizadas por espectrometria de massas. Os estudos de interação foram realizados através de ensaios de cromatografia de afinidade e supressão de fluorescência. A fluorescência intrínseca de ParEAC2 foi suprimida pelos análogos de ParD (ParDTB1, ParDTB3, ParDTB5 e ParDTB6), evidenciando a formação de complexos estáveis entre as espécies, resultados confirmados pelos ensaios de cromatografia de afinidade. Resultados semelhantes foram obtidos empregando a proteína ParD obtida por expressão heteróloga. Com base nos resultados obtidos, foi possível concluir que o análogo ParDTB1 representa uma estrutura peptídica mínima com potencial para neutralizar o efeito da toxina ParE.