Staphylococcus spp. isolados de mastite subclínica bovina em diferentes estados brasileiros: resistência antimicrobiana, detecção dos fatores de virulência e identificação do perfil clonal - Mello, Priscila Luiza [UNESP] (2017)
A mastite é considerada um grande problema na pecuária leiteira e o uso frequente de antimicrobianos contribui para o aumento da pressão seletiva de micro-organismos resistentes aos principais fármacos. A Organização Mundial da Saúde Animal tem alertado para o risco da resistência antimicrobiana resultante do uso indevido de antimicrobianos no tratamento de animais doentes. O presente trabalho tem como objetivos identificar e caracterizar o perfil clonal, bem como os fatores de virulência e de resistência aos antimicrobianos em Staphylococcus spp. isolados do leite de bovinos com mastite subclínica de várias regiões do Brasil. As amostras foram concedidas pela Embrapa Gado de Leite, provenientes de 6 estados brasileiros, incluindo Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, Minas Gerais, São Paulo e Pernambuco. Foram incluídas 181 amostras de Staphylococcus spp. no estudo. A identificação fenotípica revelou um total de 82 (45,3%) Staphylococcus aureus e 99 (54,7%) Staphylococcus coagulase negativa (CoNS). Destes, a espécie mais isolada foi S. chromogenes com 27 (14,9%) amostras, seguido de S. epidermidis com 26 (14,3%). Realizou-se a confirmação genotípica utilizando a técnica Internal Transcribed Spacer - PCR (ITS-PCR) de todas as amostras, demonstrando um total de 98% de concordância com o teste fenotípico. Quanto à determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), S. aureus revelou 99% de sensibilidade à oxacilina, enquanto os CoNS apresentaram 32% de resistência à esse antimicrobiano. Já para a vancomicina, todas as amostras foram sensíveis, apresentando apenas susceptibilidade reduzida pelo método de triagem, onde 13 amostras cresceram em BHI ágar com concentrações de 4μg/mL e 6 μg/mL de vancomicina. Com referência à produção de beta-lactamase foi possível observar que 96% das amostras de Staphylococcus spp. foram positivas. O gene mecA foi detectado em 8 amostras, todas do grupo CoNS e a tipagem do SCCmec revelou isolados do tipo I e tipo IV. Nas amostras em que não foram encontrados o gene mecA, foi realizada pesquisa do mecA homólogo (LGA251) e um total de 12 amostras apresentaram um produto de PCR com tamanho semelhante ao esperado para o gene mecC. No entanto o sequenciamento das amostras revelou similaridade de 99% com um gene ancestral do mecA. Através da técnica de PCR foram pesquisados os genes do operon ica responsáveis pela produção de biofilme,sendo detectados o gene icaA em 79 amostras (43,6%), o icaB em 24 (13,2%), o icaC em 57 (31,4%) e o icaD em 127 (70,1%). O gene bap foi detectado em 66 amostras (36,4%), enquanto o gene bhp foi encontrado apenas em 9 (4,9%) amostras de S. epidermidis. Já os ensaios de expressão por RT-qPCR comprovaram a expressão do gene icaA em 60 amostras (33%) do icaB em 6 (3,3%), do icaC em 26 (14,3%) e do icaD em 80 (44%). Quanto aos genes de enterotoxinas, o estudo revelou o gene sea como o mais frequente, sendo detectado em 18,2% das amostras, o gene seb em 7,7%, o sec em 14,9%, o sed 0,5%, o see em 8,2%, o sei em 6,6%, e o ser em 1,6%. Os genes ses, set e tst não foram detectados em nenhuma das amostras. A tipagem do perfil clonal das amostras pela técnica de Pulsed Field Gel Electrophoresis permitiu a identificação de oito clones de S. aureus que incluíram simultaneamente, ≥3 amostras, com similaridade ≥80%. Em relação às outras espécies estudadas, houve a formação de três grupamentos para a espécie S. chromogenes, enquanto para S. epidermidis quatro clusters foram detectados. Já ao analisar S. saprophyticus, foi possível observar apenas um grupamento. Quanto ao Multilocus Sequence Type (MLST) para o sequenciamento dos sete genes housekeeping, os ST prevalentes em S. aureus foram ST126 e ST1 enquanto em S. epidermidis, os ST foram todos distintos.