Biologia sintética aplicada no desenvolvimento de uma vacina recombinante para o controle da leishmaniose visceral canina - Santos, Gabriel Duarte dos [UNESP] (2022)
A Leishmania infantum (syn. Leishmania chagasi) é o agente etiológico da leishmaniose visceral, presente nas Américas, tendo os cães como seu principal reservatório do parasita, seguido de posterior ocorrência de casos humanos. Para controle da doença, novas soluções preventivas em cães, como a produção de novas vacinas, faz-se necessário. Um fragmento protéico de 206 aminoácidos de L. infantum denominada Lc24, que já teve sua antigenicidade anteriormente avaliada pelo nosso grupo de pesquisa, é alvo do presente estudo. Primeiramente foi feita a clonagem do fragmento correspondente a 624 pb no vetor pMAL-p5X para a obtenção de um produto protéico fusionado à proteína Maltose Binding Protein (MBP), seguido de confirmação por sequenciamento. Devido ao insucesso da expressão da proteína recombinante, utilizou-se como estratégia alternativa a síntese de peptídeos. Para isso, utilizouse uma estratégia de imuno-informática para seleção de epítopos contidos em sequências peptídicas pequenas, passíveis de serem sintetizadas, mas que guardassem as propriedades imunológicas de Lc24. A sequência protéica completa foi analisada utilizando os servidores BepiPred 2.0 e o ABCpred para reconhecimento de regiões de epítopos referentes a células B e, posteriormente, os servidores EpiDOCK, Rankpep, IEDB e NetMHCpan, para a predição de epítopos para os alelos H-2Kb, H-2Kd, H-2Db, H-2Dd e H-2Ld (para MHC-I) e IA-b, I-Ad e IE-d (para MHC-II), para reconhecimento por células efetoras do tipo T (CD4+ e CD8+ ). Os peptídeos selecionados também foram analisados in silico quanto a propriedades de antigenicidade, alergenicidade, toxicidade e similaridade frente a sequências de proteínas caninas e humanas. Dentre os diferentes peptídeos identificados, selecionou-se o peptídeo GD2102, tendo como base a metodologia de classificação de melhor peptídeo estudado neste trabalho para a síntese química. Importante destacar que foi adicionado uma valina na porção N-terminal para ajudar na estabilidade e solubilidade do peptídeo, e a sequência peptídica RS09, um conhecido adjuvante sintético. Adicionalmente, parte dos peptídeos também foram encapsulados em lipossomas para promover um processo mais lento de liberação. Embora não tenha sido detectado anticorpos IgG, IgG2 e IgG2a antígeno específicos em camundongos BALB/c e swiss imunizados com os peptídeos livres ou encapsulados (dias 0, 14 e 21 para a linhagem BALB/c e dias 0 e 14 para a linhagem swiss), novas análises são necessárias como a adição de uma aplicação de uma terceira imunização e/ou aumento na quantidade de peptídeos livres e encapsulados.