Avaliação da termoestabilidade e aplicação biotecnológica de endo-xilanases GH11 obtidas por otimização in silico - Ramos, Felipe Cardoso [UNESP] (2017)
O processamento da biomassa lignocelulósica para a produção do etanol de segunda geração (E2G) e outras aplicações requer enzimas termoestáveis capazes de operar sob altas temperaturas e longos períodos de incubação. Nesse contexto, reportamos aqui a validação experimental preliminar de uma abordagem in silico para a obtenção enzimas hidrolíticas termoestáveis. Simulações computacionais da endoxilanase GH11 de Bacillus subtilis (XBS) usando a metodologia de otimização de interações eletrostáticas (EIO) indicaram três resíduos (K99, R122 and K154) críticos para o aumento da termoestabilidade através da substituição de cargas. Assim, analisamos os efeitos da mutação K99E em diversas propriedades da XBS selvagem (XBSWT) e também de uma XBS obitida in vitro através de evolução dirigida (XBSM6). Após expressão heteróloga em células de Escherichia coli BL21 e purificação através de cromatografia de afinidade, realizamos a caracterização bioquímica e biofisica das enzimas. Além disso, conduzimos estudos de termotolerância incubando as enzimas em condições industriais (pH 4,8 e 50 °C). Finalmente, realizamos testes de suplementação de um coquetel enzimático comercial esperando obter melhoras no processo de hidrólise da biomassa. Os resultados mostraram que a mutação K99E foi capaz de aumentar a temperatura de desnaturação térmica (Tm) das enzimas em aproximadamente 1 °C e melhorar a termotolerância de XBSWT e XBSM6 sem alterar suas condições ótimas. Somado a isso, a enzima XBSM6+K99E apresentou melhor performance nos ensaios de suplementeção. Estes resultados sugerem que a abordagem de EIO pode ser usada como estratégia inicial para o desenho de novas endo-xilanases GH11 termoestáveis, capazes de suportar as condições operacionais empregadas na industria de E2G.