Investigação de mecanismos genéticos associados às vias de formação de ossos intermusculares no Tambaqui (Colossoma macropomum) - Bronze, Emily [UNESP] (2020)
Diversas espécies de peixes de importância na aquicultura mundial possuem ossos intermusculares (IBs) ou espinhas, como são popularmente conhecidos. Esses IBs são uma característica comercialmente indesejável por reduzir a palatabilidade dos peixes, sendo necessária sua remoção para a produção do filé, o que resulta em impactos econômicos e de frescor do produto. O tambaqui, Colossoma macropomum, é uma espécie dulcícola neotropical da ordem Characiformes que apresenta grande potencial para a aquicultura, mas que, no entanto, possui a desvantagem de gerar os IBs. Recentemente, numa população cultivada de tambaqui, foram reportados indivíduos com ausência de IBs, sugerindo que variantes genéticas e/ou epigenéticas estejam associadas à geração do fenótipo mutante. O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos moleculares associados à formação dos ossos intermusculares, de modo a contribuir para a geração de animais com maior valor econômico agregado. Para isso foi analisada a expressão de genes codificadores e genes não codificadores associados às vias de formação dos IBs, além da caracterização temporal de formação dos IBs durante o desenvolvimento. Com base na literatura, foram inicialmente selecionados para estudo três genes candidatos à atuação nas vias de ossificação intramembranosa: bmp4, runx2 e mstn. Estes foram avaliados na F1 quanto à expressão no intervalo de crescimento que compreende desde o início até a completa formação dos IBs, nos comprimentos 18, 20, 23 e 26mm. Inicialmente foi realizada a desova com as matrizes que apresentaram o fenótipo mutante desejado (sem IBs) e um grupo controle (com IBs), seguido do cultivo dos alevinos e monitoramento dos mesmos para determinação do momento de início da ossificação dos IBs ou verificação de ausência destes. Posteriormente foi realizada a coleta de tecidos da região próxima ao pedúnculo caudal seguida da extração de RNA e síntese de cDNA desses indivíduos para subsequente análise de perfis de expressão gênica por qPCR. Concomitantemente, foi realizada a fixação e diafanização de alevinos em diferentes fases do desenvolvimento para a caracterização morfológica dos IBs. O RNA total foi isolado das matrizes mutante e controle para sequenciamento em larga escala de miRNAs (miRNA-Seq). Como resultados verificou-se que os IBs no tambaqui são formados a partir de 15 mm de comprimento total, anterior ao previamente reportado para outros teleósteos. A análise comparativa de expressão do bmp4 revelou diferença significativa entre mutantes e controle, havendo uma diminuição na expressão na F1 dos grupos mutantes, principalmente nos comprimentos considerados de ativa mineralização óssea (i.e., 20 e 23mm). O runx2b também apresentou diferença significativa entre mutantes e controle, porém o pico de diminuição de expressão ocorreu nos animais com 20mm de comprimento. Por outro lado, a mstn apresentou, um aumento significativo de expressão nos mutantes sem IBs na comparação aos animais controle, sugerindo possível envolvimento desses genes nas vias associadas a formação dos IBs. O miRNA-seq revelou a expressão de miRNAs importantes para a regulação de vias de formação óssea, incluindo os atuantes na regulação dos três genes codificantes alvo analisados, além da detecção de novos miRNAs exclusivamente expressos apenas nos tambaquis mutantes sem IBs. Este é um dos primeiros estudos onde avaliou-se a expressão de genes envolvidos na formação óssea em espécie de peixe neotropical, cujos espécimes foram obtidos pelo acasalamento de matrizes mutantes sem IBs. Adicionalmente trata-se da primeira análise do microRNAoma completo para investigação do fenótipo mutante sem ossos intermusculares. Esses dados inéditos gerados fornecem subsídios para trabalhos futuros visando a produção de linhagens de tambaqui sem IBs, com grande potencial para melhoria de produtividade na aquicultura.