Estudo comparativo entre diferentes técnicas biofísicas visando aprofundar o entendimento do mecanismo de importação nuclear - Oliveira, Hamine Cristina de [UNESP] (2024)
O estudo quantitativo da interação proteínas-ligantes vem se mostrando essencial em diversas áreas. No estudo da importação nuclear, particularmente na chamada via clássica de importação nuclear, estes dados são essenciais, pois a importina-α (Impα) se acopla às proteínas a serem transportadas ao núcleo a partir do reconhecimento de sequências de localização nuclear (NLS). Assim, o aprimoramento no uso de métodos biofísicos de análise da interação macromolécula/ligante tem um papel fundamental. Desta maneira, o presente trabalho tem duas vertentes principais: i) comparar a interação da Impα com NLSs de proteínas cargo por diferentes técnicas, como a calorimetria por titulação isotérmica (ITC), a espectroscopia de fluorescência, a termoforese em microescala (MST) e o docking molecular, analisando as principais diferenças entre cada uma delas. Esta comparação é pouco abordada na literatura e se mostrou promissora, uma vez que apesar de utilizar princípios físicos diferentes as técnicas obtiveram valores na mesma ordem de grandeza. (ii) Desenvolvimento de um algoritmo de código aberto para a análise de dados de ITC, suprindo a dificuldade que os softwares comerciais apresentam no cálculo dos parâmetros em sistemas mais complexos. Os dados de ITC entre a Impɑ e diferentes NLSs foram utilizados como referência para a comparação entre as constantes de afinidade obtidas nas outras técnicas e como validação para o algoritmo. Os mesmos ligantes foram utilizados nos ensaios de espectroscopia de fluorescência, termoforese em microescala e docking molecular. Apesar de bastante distintas, todas as técnicas obtiveram valores da constante de dissociação na mesma ordem de grandeza. Os valores obtidos por docking molecular são superestimados. Como a fluorescência e o MST não diferenciam as constantes para cada sítio de ligação, o valor encontrado representa uma afinidade média de ambos os sítios. Nota-se, uma maior semelhança entre os dados de ITC e fluorescência. O algoritmo de ITC teve resultados similares aos obtidos pelo software do fabricante, sua implementação trará um avanço para a facilitação da análise de dados complexos.