Atividade antibacteriana e mecanismos de ação da melitina e sua associação com oxacilina frente ao Staphylococcus aureus meticilina resistente (MRSA) - Pereira, Ana Flávia Marques [UNESP] (2022)
A resistência bacteriana é um problema de saúde pública mundial e isolados resistentes como o Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA), frequentemente causam infecções graves e de difícil tratamento. A pesquisa por novos agentes antimicrobianos é necessária e produtos naturais como os peptídeos antimicrobianos têm sido evidenciados, como é o caso da melitina, uma fração do veneno da abelha Apis mellifera, que já possui ação antimicrobiana reportada. A melitina pode apresentar atividade hemolítica, sendo ideais novas estratégias como um sinergismo com antibióticos ou associada a sistemas nanocarreados, como nanopartículas ou nanoemulsões. Os objetivos desse trabalho foram sintetizar uma nanopartícula de ouro conjugada com melitina (AuNPs melitina) e duas formulações diferentes de nanoemulsões contendo melitina, avaliar a atividade antibacteriana da melitina, da sua associação com oxacilina, dos antibióticos oxacilina e cefalotina, da AuNPs melitina e das nanoemulsões sobre MRSA ATCC 33591 e um MRSA isolado clínico, avaliar atividade antibiofilme dos produtos que apresentaram atividade antibacterina e investigar os seus mecanismos de ação sobre MRSA. As nanopartículas de ouro (AuNPs) foram funcionalizadas com citrato de sódio e ativadas com 1-etil-3-(3- dimetilaminopropil)carbodiimida (EDC) e N-hidroxisuccinimida (NHS) e posterior conjugação da melitina; também foi realizada a síntese de duas formulações diferentes de nanoemulsões contendo melitina. A atividade antibacteriana sobre os isolados foi realizada de acordo com a metodologia Resazurin Microtiter Assay (REMA), para determinar a concentração inibitória mínima (CIM) da melitina, antibióticos, AuNPs melitina e nanoemulsões com melitina. O sinergismo da melitina com antibióticos (oxacilina e cefalotina) foi testado por meio da curva de sobrevivência (time kill curve). A ação antibiofilme de melitina, oxacilina e da associação de melitina com oxacilina (mel+oxa) e a ação desses produtos sobre a membrana celular dos isolados foram verificadas. Ensaios de atividade hemolítica e de citometria de fluxo, citotoxicidade em células HaCaT, foram realizados. Os mecanismos de ação dos produtos testados com atividade antibacteriana foram investigados por meio da análise proteômica, sendo que a cepa MRSA ATCC foi tratada com concentrações subinibitórias dos tratamentos. As AuNPs melitina e as duas nanoemulsões diferentes contendo melitina foram sintetizadas, obtendo uma concentração final de 250 μg/mL de melitina em cada nanoestruturado, sendo que nenhum nanoestruturado apresentou ação antibacteriana frente à MRSA. A melitina apresentou uma CIM de 5,3 µg/mL sobre MRSA ATCC e de 4,0 µg/mL para MRSA isolado clínico; já a oxacilina apresentou CIM de 16 µg/mL para MRSA ATCC e de 8 µg/mL para MRSA isolado. A associação mel+oxa mostrou ser sinérgica e bactericida para ambos MRSA. Concentrações subinibitórias da mel+oxa foram capazes de reduzir a formação de biofilme de MRSA ATCC e concentrações suprainibitórias foram capazes de erradicar biofilmes estabelecidos. A melitina e mel+oxa mostraram ter ação sobre a permeabilidade da membrana celular pelo aumento na condutividade elétrica relativa, extravasamento de proteínas, liberação de ácidos nucleicos e efluxo de íons potássio e fosfato. A taxa de hemólise da melitina em sua CIM foi de 0,2%, já a combinação de mel+oxa, em sua CIM não apresentou hemólise em eritrócitos humanos. A melitina e mel+oxa não causaram apoptose ou morte tardia em células de queratinócitos HaCaT. A análise proteômica sobre MRSA ATCC mostrou que a melitina, oxacilina e mel+oxa causaram uma expressão diferencial de proteínas em relação ao controle, indicando ação sobre a síntese proteica e metabolismo energético. Os nanoestruturados contendo a melitina não apresentaram atividade antibacteriana nas concentrações e formulações testadas sobre MRSA. O tratamento mel+oxa mostrou atividade antibacteriana e antibiofilme sobre MRSA, não apresentou hemólise no valor da CIM e nem citotoxicidade em células HaCaT e mostrou ação sobre a membrana celular de MRSA e sobre diferentes alvos intracelulares, afetando principalmente o metabolismo energético e a síntese proteica de MRSA. A associação de melitina e oxacilina apresenta considerável potencial para o desenvolvimento de agentes antibacterianos ou de novos tratamentos contra MRSA.