Metarhizium anisopliae : estudo funcional do gene emp1 e análise transcricional de quitinases em diferentes estágios de diferenciação celular - Souza, Bárbara Kunzler (2011)
Para infectar seus hospedeiros artrópodes, Metarhizium anisopliae produz uma série de enzimas hidrolíticas e diversas alterações morfológicas como a formação de estruturas denominadas de apressórios e blastosporos. Estas estruturas de infecção representam estágios cruciais de penetração e disseminação no inseto hospedeiro, respectivamente. Além disso, o apressório é uma estrutura conservada entre fungos entomopatogênicos e fitopatogênicos. O gene emp1 (codifica uma proteína de matriz extracelular de Magnaporthe grisea) parece ter um papel importante na diferenciação do apressório, bem como na patogenicidade e virulência. Um dos nossos objetivos foi avaliar a possível função de um ortólogo do gene emp1 em M. anisopliae pela análise do perfil transcricional e construção de mutantes funcionais por mutagênese insercional utilizando agrotransformação. Foram geradas linhagens transformantes contendo o cassete de inativação do gene emp1 (pPZP::bar::emp1), sendo este construído pela subclonagem das regiões flanqueadoras 5’ (1.515pb) e 3’ (1.513pb), fusionadas a um cassete de expressão do gene bar (3.500pb) que confere resistência a glifosinato de amônia. A freqüência de transformação observada nesta etapa de transformação foi superior a 60%, porém em apenas 1,5% dos transformantes há indícios de recombinação homóloga. Também foi analisado o perfil transcricional de emp1, sob três condições anteriormente padronizadas: células diferenciadas em apressório, hifas (crescimento vegetativo), e blastosporos, sendo observada a presença de transcritos deste gene em todas as condições testadas. Em uma segunda etapa deste trabalho, foi avaliado o perfil transcricional de quitinases putativas de M. anisopliae nos estágios de diferenciação celular de apressório, hifas e blastosporos. Esta classe de proteínas está diretamente envolvida no remodelamento da parede celular fúngica durante a diferenciação celular, como também na degradação da quitina da cutícula do hospedeiro durante a etapa de penetração. Originalmente foram caracterizados três genes para quitinases (chit1, chi2 e chi3), e a análise in silico do genoma revelou outras 20 quitinases putativas de Metarhizium. Essa diversidade pode ser responsável pelas diferentes funções que o conjunto de enzimas quitinolíticas tem na degradação de quitina durante o ciclo de vida e de infecção do fungo. É, portanto importante: (i) validar transcricionalmente as quitinases putativas e (ii) tentar atribuir função a cada uma delas. Para isso, procedemos a análise dos transcritos de cada uma das 23 quitinases putativas sendo sintetizados cDNAs a partir das três condições de diferenciação celular (apressório, hifas e blastosporos). Na condição de diferenciação a apressório dez espécies de transcritos foram detectadas sendo seis do subgrupo A, três do subgrupo B, uma do subgrupo D. Nenhum transcrito de quitinases do subgrupo C foi detectado nas condições testadas. Tanto em crescimento vegetativo quanto em blastosporos foram detectadas sete espécies de transcritos de quitinases do subgrupo A, e uma do subgrupo D. As quitinases do subgrupo B diferiram quanto a sua distribuição nas condições testadas: três espécies de transcritos foram detectadas durante o crescimento vegetativo e seis em blastosporos. O estudo envolvendo os diferentes genes putativos (emp1 e de quitinases) de M. anisopliae, sob as diversas abordagens, representa um importante precursor para nos fornecer indicativos sobre as funções destes genes no ciclo de vida e de infecção de Metarhizium.