Sistema de expressão e sequências promotoras artificiais para a regulação gênica em plantas - Scalco, Camila Bedin (2015)
A maioria das plantas transgênicas disponíveis atualmente possuem seus insertos regulados por promotores fortes que induzem uma transcrição intensa, permanente e generalizada, o que causa gastos energéticos desnecessários e dificulta a regeneração de um maior número de indivíduos transgênicos. O objetivo principal que norteou o presente trabalho foi desenvolver uma série de vetores plasmidiais contendo sequências promotoras projetadas e artificialmente sintetizadas para modular a expressão de genes de interesse em plantas. O promotor CaMV35S serviu como base para teste de elementos cis e geração de novos cassetes artificiais de expressão (CAEs). Os elementos cis TATA-box, CAAT-box e sítio de início da transcrição (TSS) originais da sequência de 90 pb do promotor mínimo CaMV35S foram substituídos pelos consensos já definidos para sequências promotoras de plantas, e a distância entre o TSS e o ATG de início da tradução, que originalmente era de 8 nucleotídeos, foi alterada para 75. Sítios de restrição para endonucleases foram introduzidos em posições estratégicas do promotor de forma a permitir a ligação dos elementos cis a serem testados e substituição de genes repórteres por genes de interesse. A distância entre o CAAT-box e o TATA-box, que originalmente era de 28 pb, foi alterada para 34 pb pela inclusão de um sítio para EcoRV na posição -46 do promotor artificial. Para compor o CAE, foram escolhidos o gene repórter tdTomato-ER e o terminador da nopalina sintase (Tnos). Foi desenvolvida, também, uma versão do CAE contendo o promotor CAMV35S (35S-CAE) integral para ser utilizada como controle positivo nesse trabalho. A partir de dados da literatura científica, foram selecionados os elementos cis W1, AC e RHE cujas atividades foram comprovadas como críticas à expressão regulada em sementes, tecidos vasculares e raízes respectivamente. Os elementos W1 e AC foram adaptados ao sítio de SmaI do CAE, dando origem às versões W1-CAE e AC-CAE. Não foram obtidas versões de RHE-CAE até o momento. Todas as versões do CAE obtidas nesse trabalho foram adaptadas ao vetor pKGW da série Gateway e empregadas para a transformação genética de Arabidopsis thaliana. Somente plantas transformadas com as versões CAE e 35S-CAE foram recuperadas. Sinais de fluorescências do gene repórter regulado pelas diferentes versões do CAE, necessários para validação da atividade promotora dos mesmos, não foram verificados em quaisquer das plantas recuperadas até o presente.