Ação tóxica da urease de Canavalia ensiformis e do peptídeo recombinante Jaburetox-2Ec sobre Oncopeltus fasciatus (Hemiptera: Lygaidade) : - Defferrari, Marina Schumacher (2010)
A Canavalia ensiformis é uma leguminosa altamente resistente ao ataque de insetos, e contribuindo para essa resistência, a planta possui isoformas de urease, que são proteínas que apresentam atividade entomotóxica. Essa toxicidade é dependente de uma ativação proteolítica da molécula por enzimas digestivas do inseto, do tipo catepsinas, e subseqüente liberação de peptídeos internos, os quais possuem a ação inseticida. A partir dessa informação foi construído um peptídeo recombinante com base na seqüência da urease, chamado Jaburetox-2Ec, o qual é tóxico para insetos resistentes e suscetíveis a urease intacta. O hemíptero Oncopeltus fasciatus é um dos nossos modelos de estudo. O objetivo deste trabalho foi identificar as principais peptidases digestivas de ninfas de O. fasciatus, auxiliando na elucidação do mecanismo de ação inseticida dessas toxinas, além de estudar os efeitos da urease intacta e do peptídeo derivado sobre órgãos isolados. Quando alimentadas com diferentes concentrações da urease majoritária de C. ensiformis (JBU), ninfas de O. fasciatus apresentam uma taxa de mortalidade superior a 80% após duas semanas, assim como quando injetadas com Jaburetox-2Ec apresentam uma taxa de mortalidade de 100% após 48 horas. Ninfas de quarto instar foram dissecadas para retirada dos intestinos e obtenção de um extrato protéico bruto, o qual foi utilizado para a realização dos ensaios enzimáticos. O extrato bruto foi capaz de hidrolisar in vitro a JBU e liberar peptídeos com massa semelhante a peptídeos entomotóxicos já conhecidos, reconhecíveis pelo anticorpo anti-Jaburetox-2Ec. A atividade proteolítica majoritária sobre substratos protéicos, em pH 4.0, foi bloqueada por inibidores específicos de aspártico e cisteíno peptidases, não sendo afetada EDTA, inibidor de metalopeptidases. Ao utilizar-se um substrato específico para cisteíno peptidases, o pico majoritário observado foi em pH 5.0, sendo a atividade completamente inibida por E-64 (inibidor de cisteíno peptidases) em todos os valores de pH testados. Ao utilizarse um substrato desenhado para aspártico peptidases, a atividade majoritária foi novamente em pH 5.0, sendo parcialmente inibida por Pepstatina A (inibidor de aspártico peptidases) é parcial em todos os valores de pH testados. Substratos sintéticos correspondentes às regiões N e C-terminal que flanqueiam o peptídeo inseticida na molécula de urease também foram testados. O primeiro não foi hidrolisado pelo extrato bruto, enquanto que o segundo apresentou um pico de atividade majoritário em pH 4.0-5.0, com inibição total por E-64. O extrato bruto foi submetido a um processo de purificação de duas etapas, uma troca iônica e uma cromatografia de gel filtração. A purificação foi monitorada utilizando-se um substrato específico para cisteíno peptidases, e a fração da gel filtração com maior atividade apresentou massa molecular de 22 kDa. A fração ativa foi submetida a um gel de poliacrilamida, a banda foi excisada e digerida com tripsina, e os peptídeos resultantes foram então analisados por espectrometria de massas. Uma catepsina L foi identificada, com massa molecular semelhante ao previsto pela gel filtração. Os resultados sugerem que a susceptibilidade de ninfas de O. fasciatus a JBU é, como em outros modelos de insetos, relacionada à proteólise limitada da proteína ingerida e posterior liberação de peptídeos inseticidas por enzimas do tipo catepsinas. Diferentes tipos de catepsinas podem estar liberando os peptídeos inseticidas a partir da urease, sendo que um cisteíno peptidase, tipo Catepsina L, pode ter um papel importante na ativação da proteína em O. fasciatus. Adicionalmente fizemos localização in situ de Jaburetox-2Ec após injeção na hemolinfa e observamos imunoreatividade no sistema nervoso central de ninfas de O. fasciatus, indicando que o peptídeo pode estar agindo neste local. Além dos efeitos tóxicos causados pelos peptídeos derivados da urease, já foram relatados em outros modelos, efeitos causados pela molécula intacta. Testamos, então, o efeito da JBU sobre contrações de intestinos ex vivo de O. fasciatus. Observamos que a urease tem a capacidade de inibir, em algumas concentrações, o efeito excitatório da serotonina sobre as contrações musculares, atividade que não é compartilhada com Jaburetox- 2Ec. Concluímos com os dados gerados nesse estudo, e em estudos prévios, que a toxicidade das ureases não só é devida à ativação proteolítica e liberação de peptídeos, mas também à proteína intacta, que parece estar causando distúrbios em processos de sinalização celular.