Estudo de interações proteicas com o produto do gene de DNA PSO5/RAD16 na levedura Saccharomyces cerevisiae - Saffi, Jenifer (1999)
O gene PSO5, alelo ao RAD 16 de Saccharomyces cerevisiae pertence a via de reparação de DNA excisão/ressíntese, também chamada de via RAD3. Este gene está implicado na reparação de lesões do tipo dímeros de pirimidina, induzidas por radiação UV, em regiões não transcritas e silenciosas do genoma, assim como em reparação de lesões oxidativas e adutos de psoraleno fotoativados. A proteína codificada por este gene pertence à família SNF2 de helicases. Neste trabalho, utilizou-se o sistema di-híbrido com o objetivo de buscar candidatos a possíveis interatores para a proteína Rad16. O sitema di-híbrido consiste de um ensaio genético desenvolvido na própria levedura, que proporciona não apenas o estudo entre interações proteicas, como também favorece o estudo dos domínios ou resíduos que podem ser críticos para que a interação aconteça. Após o screening com um banco genômico de S. cerevisiae, obteve-se três seqüências codificantes diferentes, sendo uma delas relativa ao gene SGS1, com o qual prosseguiu-se o trabalho. A proteína Sgs1 também é uma helicase, porém pertencente a família RecQ de E. coli. Ela interage com as topoisomerases II e III e está envolvida com o envelhecimento precoce em levedura. Em humanos, apresenta homologia com com as protéinas Wrn e Blm, responsáveis pelas "Síndrome de Werner" e "Síndrome de Bloom", relacionadas, respectivamente, com os fenótipos de envelhecimento precoce e predisposição ao câncer. No Capítulo I, demonstra-se que a interação entre as proteínas Sgs1 e Rad16 é fisica e genética. Através de estudos com mutantes simples e duplos, mostra-se que o gene SGS1 exerce um papel importante em reparação de DNA. Isso é devido ao fato que os mutantes sgs1 foram sensíveis a agentes alquilantes, como MMS e HN2, bem como a radiação UVC, ao UV-mimético 4-NQO e a H2O2. Observou-se uma interação epistática entre RAD16 e SGS1 para alguns destes agentes testados. Além disso, verificou-se que o tempo de geração de uma linhagem mutante rad16 é menor do que uma linhagem selvagem correspondente, sugerindo que o produto deste gene possa estar relacionado também com o envelhecimento precoce. Com a finalidade de estudar qual o domínio da proteína Sgs1 pudesse estar relacionado com reparação de DNA, utilizaram-se linhagens sgs1, contendo mutações nos seus domínios helicase e C-terminal. No Capítulo II, demonstra-se que a função helicase é responsável pela maioria dos fenótipos de sensibilidade aos agentes genotóxicos testados, bem como pela sensibilidade de sgs1 a hidroxiuréia. O fato de Sgsl interagir também com Top3 levou-nos a estudar o papel desta topoisomerase também em reparação de DNA. No Anexo, apresenta-se os resultados de sensibilidade de simples, duplos e triplos mutantes para os genes SGS1, TOP3 e RAD16. As diferentes respostas obtidas para cada agente mutagênico testado, leva-nos a concluir que estas proteínas estejam envolvidas em reparação de lesões específicas, destacando-se a importância de Top3 na reparação de alquilações do DNA.