Aperfeicoamento de método de diagnóstico para tuberculose e caracterização de Mycobacterium tuberculosis por RFLP - Rossetti, Maria Lucia Rosa (1997)
A tuberculose é ainda uma das mais importantes doenças infecciosas no mundo, particularmente em países em desenvolvimento. No Brasil, ocorrem 10 casos novos por hora e morrem 14 doentes por dia. O controle da tuberculose tem sido realizado, principalmente, na identificação e tratamento de pessoas com tuberculose ativa. Os métodos tradicionais para identificar a doença são ainda pouco sensíveis ou muito demorados. A detecção de M. tuberculosis em amostras clínicas por "polymerase chain reaction" (PCR) tem sido descrita. Entretanto, apesar do sucesso do PCR para detectar DNA de M. tuberculosis diretamente em amostras clínicas, a implantação do método na rotina de laboratórios de saúde pública não tem sido incorporada facilmente. Problemas como contaminação, inibição, métodos de extração de DNA trabalhosos e custo elevado não foram ainda totalmente resolvidos. Os métodos que permitem a caracterização de isolados de M. tuberculosis são importantes para, através de investigações epidemiológicas, correlacionar doentes e localizar fontes de infecção, possibilitando a interrupção da transmissão. Recentemente, muitos métodos foram descritos para detectar polimorfismo em diferentes regiões do DNA. No entanto, somente a técnica de "restriction fragment length polymorphism" (RFLP) tem demonstrado adequada sensibilidade e reprodutibilidade. Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de estabelecer métodos para diagnosticar a tuberculose e caracterizar isolados de M. tuberculosis. O método de diagnóstico escolhido foi baseado na técnica de PCR por ser de execução rápida e permitir detectar baixo número de microorganismos. Como a sensibilidade do PCR é bastante dependente de uma preparação da amostra antes da amplificação, esforços foram feitos, principalmente, para estabelecer um método para purificar o DNA de M. tuberculosis proveniente da amostra clínica. Uma etapa de purificação de DNA com pó de vidro foi incluída ao método de fervura. Várias amostras foram então testadas (incluindo escarro, líquor, sangue, soro e urina). Os resultados foram comparados com os diagnósticos clínico e bacteriológico dos pacientes. Também foram analisados por RFLP associado ao IS6110 e IS1081, vários DNAs de M. tuberculosis isolados no Rio Grande do Sul com o objetivo de adaptar a técnica e verificar a capacidade de distinguir os isolados. Apesar das análises por RFLP mostrarem excelente capacidade de diferenciar e correlacionar os isolados, a técnica é trabalhosa, demorada e de custo elevado, dificultando sua utilização. Assim, análises de DNA de M. tuberculosis foram realizadas por "spoligotyping" que detecta polimorfismo na região DR utilizando amplificação por PCR. Ambos os métodos foram comparados e apesar da técnica de "spoligotyping" ser mais simples e rápida que RFLP, o grau de diferenciação obtido dos isolados foi menor para espécies com alto número de cópias de IS6110. No entanto, a metodologia mostrou potencial para sua utilização em rotinas de laboratórios se mais oligonucleotídeos forem incluídos no teste.