Aplicação de CLAE-DAD-EM e CG-EM na caracterização de Blechnum sp. e abordagens in vitro e in silico para a avaliar o perfil multifuncional do ácido rosmarínico em alvos relacionados à neurodegeneração e toxicidade em células-tronco - Fasolo, Juliana Maria de Mello Andrade (2015)
As plantas medicinais são consideradas importantes fontes de compostos biologicamente ativos. Para muitas doenças crônicas, como as neurodegenerações, substâncias que apresentam atividades simultâneas em mais de um alvo relacionado à etiopatologia dessas desordens, constituem potenciais agentes terapêuticos. Nesse contexto, os objetivos deste trabalho foram a avaliação química e biológica de três espécies de samambaias de ocorrência no sul do Brasil: Blechnum binervatum, B. brasiliense e B. occidentale. O isolamento bioguiado foi utilizado para a identificação da(s) substância(s) com potencial atividade em modelos in vitro e in silico relacionados às desordens neurodegenerativas. A avaliação dos extratos e frações permitiu destacar a fração acetato de etila de B. brasiliense como a mais ativa na estabilização de radicais hidroxila (CI50: 12,5 μg/mL) e na inibição da lipoperoxidação (CI50: 10,4 μg/mL), sendo uma das mais ativas frente ao óxido nítrico (CI50: 55,6 μg/mL). Adicionalmente, na inibição da isoforma A da enzima monoamina oxidase (MAO), esta fração foi a que apresentou menor valor de CI50 (28,6 μg/mL). As frações diclorometano também apresentaram bons resultados na inibição da MAO-A, sendo algumas ativas igualmente como antioxidantes. Frente à MAO-B, os extratos e frações das três espécies vegetais demonstraram menores efeitos e foram inativos frente às enzimas acetil e butiril colinesterase, não demonstrando toxicidade em células polimorfonucleares (PMN) de ratos Wistar, na concentração de 1 mg/mL. Utilizando células-tronco cultivadas, os extratos e frações selecionadas, nas concentrações de 100 a 500 μg/mL, não afetaram a viabilidade celular e não apresentaram efeitos tóxicos. Análises químicas por cromatografia líquida de alta eficiência, acoplada a detector de arranjo de diodos e espectrometria de massas, permitiram a identificação de isômeros dos ácidos cafeoil quínico e cafeoil chiquímico nos extratos das três espécies estudadas. B. binervatum apresentou, ainda, ácido cafeico glicosilado, ácido isosalvianólico A e ácido rosmarínico sulfatado. Ácido salvianólico F foi identificado em B. binervatum e B. occidentale, bem como isômeros do ácido brainico. Ácido rosmarínico foi caracterizado em B. binervatum e B. brasiliense. Quercetina 3-O-glicosídeo e vicenina-2 também foram identificadas. As análises por cromatografia gasosa, acoplada à espectrometria de massas demonstraram que o diterpeno neofitadieno foi o composto majoritário nas frações diclorometano de Blechunm e nas frações hexano de B. occidentale e B. binervatum. Para a fração hexano de B. brasiliense, β-sitosterol foi o principal componente. A partir da fração acetato de etila de B. brasiliense foi isolado o ácido rosmarínico, o qual se mostrou ativo nos ensaios de atividade antioxidante, na inibição da catecol-O-metil transferase (CI50: 26,7 μM) e da MAO-A (CI50: 50,1 μM), sendo proposto mecanismo reversível de inibição desta enzima. Nos estudos de docking foram verificadas as interações moleculares entre o composto e as enzimas MAO-A e COMT, por ligações de hidrogênio e interações hidrofóbicas nos sítios ativos enzimáticos. O composto não apresentou efeitos tóxicos em células PMN de roedores, nas concentrações de 0,5 e 5 mM. Os ácidos rosmarínico e clorogênico isolados do extrato de B. binervatum não influenciaram na viabilidade celular e não induziram efeito tóxico sobre células-tronco (100 a 500 μM), sendo que o ácido rosmarínico foi capaz, ainda, de induzir proliferação celular. Capacidade protetora contra danos celulares causados por H2O2 (1400 μM) foi observada para ambas as substâncias, nas concentrações de 10-100 μM, sendo os resultados corroborados pelas imagens de microscopia celular. O ácido rosmarínico apresentou melhores respostas quando comparado ao ácido clorogênico, sendo mais efetivo na inibição dos danos por H2O2. O conjunto dos resultados obtidos ressalta a importância dos estudos associados químico-biológico de espécies vegetais e aponta para as potencialidades de samambaias como fontes de produtos bioativos, capazes de atuar sobre múltiplos alvos enzimáticos e não-enzimáticos relacionados a doenças neurodegenerativas.