Purificação e imobilização de uma protease queratinolítica produzida por Chryseobacterium sp. linhagem Kr6 - Silveira, Silvana Terra (2009)
Queratinases (E.C. 3.4.21/24/99.11) são um grupo de enzimas proteolíticas que catalisam a hidrólise da queratina. A linhagem queratinolítica Chryseobacterium sp. kr6 apresenta elevada produção de queratinases extracelulares, demonstrando potencial para bioconversão de substratos constituídos por queratina. O presente trabalho teve como principal objetivo purificar e imobilizar uma queratinase produzida pelo Chryseobacterium sp. kr6. As condições ótimas para a atividade proteolítica da queratinase foram estabelecidas com o auxílo das ferramentas estatísticas de planejamento experimental e superfície de resposta. Os resultados demonstraram que tais condições foram atingidas ao utilizar pH na faixa de 7,4 a 9,2, 35°C a 50°C e concentração de NaCl de 50 a 340 mmol L-1. A especificidade da queratinase frente a diferentes substratos também foi investigada, indicando a preferência da enzima por resíduos hidrofóbicos ou positivamente carregados. A completa purificação da queratinase envolveu a precipitação com sulfato de amônio, cromatografias de permeação em gel e troca aniônica. A amostra obtida após as referidas etapas apresentou um fator de purificação de 40,2 vezes e atividade específica de 21.466 U mg-1 de proteína. A massa molecular da enzima, determinada por SDS-PAGE, foi, de aproximadamente, 20 kDa. Os parâmetros cinéticos e termodinâmicos para a inativação térmica da queratinase, sob diferentes condições, foram estimados. A partir dos resultados obtidos, observou-se que a presença de cálcio aumenta significativamente a estabilidade térmica da enzima. Comparando com as amostras controles, o tempo de meia vida da enzima purificada na presença de Ca2+ aumentou 7,3, 20,2 e 9,8 vezes, a 50°C, 55°C e 60ºC, respectivamente. A atividade enzimática foi significativamente inibida na presença de EDTA e 1,10-fenantrolina, sugerindo se tratar de uma metaloprotease. O desenvolvimento de um suporte a base de quitosana para a imobilização covalente da queratinase purificada foi investigado. Para isso, foram avaliados os efeitos de diferentes concentrações de glutaraldeído e tempo de contato deste com as esferas de quitosana, sobre o percentual de imobilização da enzima. Os melhores resultados obtidos para a imobilização da queratinase ao suporte foram ao utilizar concentração de glutaraldeído na faixa de 34 a 56 g L-1 e um período de ativação das esferas na faixa de 6 a 10 h. Sob tais condições, obteve-se 80% de imobilização da enzima. A partir das condições ótimas para a imobilização da enzima ao suporte, apontadas pela metodologia de superfície de resposta, estimou-se a capacidade de carga máxima do suporte, sendo esta de 58,8 U g-1. A enzima imobilizada apresentou maior estabilidade térmica quando comparada com a forma livre, além de reter 63,4% da atividade enzimática inicial após cinco reutilizações.