Mutação e superexpressão de p53 em neoplasias mamárias de cadelas - TEIXEIRA, Maria Juliana Coelho Dias da Silva (2007)
A incidência e o nível de mortalidade associada a diversidade dos fenótipos de câncer requerem estratégias para seu diagnóstico. Neste trabalho, objetivou-se avaliar a relação das mutações no gene Tp53 com o câncer de mama em cadelas, através da expressão imunoistoquímica da proteína p53 e do polimorfismo do gene nos tecidos mamários. No Experimento 1 foi verificada a expressão imunoistoquímica da proteína p53 associando-a ao aspecto morfológico de tecido glandular mamário sadio, a classificação e gradação dos tumores mamários e ao tecido linfonodal inguinal ipsilateral, (com ou sem metástase). Para isso foram utilizadas 19 mamas normais (Grupo 1 - controle), 29 amostras de mamas com diagnóstico clínico de tumor (Grupo 2), 29 mamas contra laterais (Grupo 3) e 29 linfonodos (Grupo 4). O material foi analisado por técnicas convencionais de microscopia (coloração HE) para caracterização dos tecidos e por imunoistoquímica (método da estreptavidina-biotina peroxidase) para avaliar a expressão da proteína p53 nos compartimentos celulares. As mamas do Grupo 2, pela análise histopatológica, apresentaram 65,52% de tumores malignos e 13,79% de tumores benignos. Foram observadas metástases em 6,9% das mamas contra laterais (Grupo 3) e em 31,03% dos linfonodos (Grupo 4). A marcação imunoistoquímica, para expressão de p53, não foi observada em tecidos de animais normais, mas foi evidente tanto em células de tumores malignos quanto benignos localizando-se no núcleo, no citoplasma ou em ambos compartimentos celulares. As mamas contra laterais e os linfonodos que apresentaram metástase também foram marcados, bem como tecidos que ainda apresentavam padrão de normalidade. Não houve diferenças estatísticas entre a intensidade da marcação e do número de células marcadas com o grau de malignidade. No Experimento 2, o objetivo foi detectar mutações em seqüências do exon 8 do gene Tp53 através da técnica PCR-RFLP com enzimas específicas de restrição para associar o padrão de bandas obtidas ao tipo de tumor de mama ou tecido de glândula mamária normal de cadelas. Foram utilizadas 19 cadelas sadias (controle) e 50 cadelas submetidas à retirada de tumor das quais foram obtidas amostras dos tecidos tumorais e de glândulas mamárias sadias contra laterais. A extração de DNA foi realizada pela técnica de fenol-clorofórmio e a PCR-RFLP foi utilizada para amplificação e digestão do exon 8 do Tp53 com 6 endonucleases de restrição, SmaI, DdeI, Rsa, AvaI, BsobI e AluI. O DNA amplificado apresentou uma única banda de 200 pb no gel de agarose 0,8%. O produto de PCR apresentou em média 94% de homologia com a seqüência conhecida do gene (GeneBank –AAB42022.1). Das 6 enzimas selecionadas, apenas 4 apresentaram polimorfismo (AluI, BsobI, DdeI e SmaI) na seqüência do exón 8 do tumor quanto ao número dos pares de base nucleotídeos (pb) ou quantidade de clivagens. O padrão das bandas de cada enzima apresentou polimorfismo entre os grupos diferentes, mas não dentro do seu grupo (cadelas normais, glândulas mamárias com tumor e mama contra lateral ao tumor). Não houve diferença entre os tecidos de mamas com tumor e as contra laterais do mesmo animal, para as enzimas AluI, BsoBI e SmaI, reforçando a idéia de que os tecidos que ainda não apresentam alteração visível, já se encontram alterados no nível molecular e portanto são potencialmente capazes de desenvolver tumores ao longo do tempo.Conclui-se que o gene Tp53 está fortemente envolvido na etiologia das neoplasias de mamas em cadelas, podendo ser utilizado como parâmetro para analisar o comportamento destes tumores. A análise da expressão da proteína p53 associada a marcadores genéticos que identificam mutações na seqüência do gene, pode propiciar o marcadores genéticos que identificam mutações na seqüência do gene, pode propiciar o diagnóstico precoce da patologia, permitindo o tratamento em tempo de evitar metástases.