Venoma da cascavel brasileira Crotalus durissus terrificus e caracterização de um inibidor recombinante de fosfolipase A2: um possível adjuvante na terapia do envenenamento - Wiezel, Gisele Adriano (2021)
Os acidentes ofídicos no Brasil vêm aumentando ano a ano e são considerados um problema negligenciado de saúde pública. O único tratamento eficaz é a administração do soro antiofídico, mas reações adversas estão relacionadas à sua administração. A crotoxina, um complexo de fosfolipases A2 (PLA2), é um dos componentes mais estudados da peçonha crotálica, mas muitos outros componentes são menos conhecidos devido a sua baixa abundância. Portanto, o presente estudo objetivou a análise do transcriptoma da glândula e do proteoma da peçonha da serpente Crotalus durissus terrificus, bem como a caracterização bioquímica e funcional de um inibidor de PLA2 (PLI) recombinante dessa serpente. A biblioteca de cDNA da glândula de peçonha foi construída usando a plataforma Illumina e o seu proteoma foi investigado através de cromatografia líquida de alta resolução acoplada à espectrometria de massas. A integração de ambos os conjuntos de dados permitiu a análise do venoma, sendo que mais de 30 famílias de componentes foram identificadas no transcriptoma, das quais 15 também foram detectadas no proteoma da peçonha. No entanto, poucas famílias (PLA2, SVMP, SVSP e VEGF) são relativamente abundantes e apenas 7 transcritos contribuem com ~82% e ~73% da abundância no transcriptoma e no proteoma, respectivamente. Também foram identificadas sequências de PLIs, que surgem como uma possibilidade de adjuvante na terapia do envenenamento. Esses inibidores são proteínas geralmente encontradas no sangue de serpentes que, recentemente, também têm sido identificadas em glândulas de peçonha. Sendo assim, o gene sintético do inibidor CdtPLI-2 foi expresso em células de Pichia pastoris KM71H em meio BMMY com casaminoácidos 1,5%. A seguir, o PLI recombinante rCdtPLI2 foi purificado do meio de cultura através de diferentes etapas cromatográficas e não foi reconhecido pelo soro anticrotálico comercial. O sequenciamento amino-terminal confirmou sua expressão e sua massa molecular foi determinada por MALDI-TOF (41643,599 Da). A digestão do rCdtPLI2 com PNGase F/alfa-manosidase permitiu análise de sua glicosilação e a retirada total do açúcar deixou a proteína insolúvel. O rCdtPLI2 glicosilado não é capaz de inibir PLA2 ofídicas, mas sua digestão com alfa-manosidase forneceu um inibidor deglicosilado com ação inibitória sobre PLA2 de diferentes peçonhas ofídicas brasileiras, incluindo PLA2 ácidas e básicas. As PLA2 CB-Cdc e Lmr-PLA2 são significativamente inibidas a partir da proporção de 1:10 (inibidor:toxina). Para a CTx-Cdc, grande inibição é vista a partir da proporção 1:5. Além disso, uma análise preliminar in vivo revelou que o rCdtPLI2 deglicosilado pode ser um agente promissor na diminuição do edema causado pela CTx-Cdc. O inibidor (brCdtPLI2) também foi expresso em células de E. coli BL21(DE3)pLysS em meio LB, com indução mantida por IPTG 0,5 mM. Posteriormente, o brCdtPLI2 foi isolado do lisado celular através de diferentes etapas cromatográficas e um ensaio de inibição mostrou que ele inibe a ação enzimática da CB-Cdc, apresentando-se promissor na inibição de outras PLA2 ofídicas e com a vantagem de ausência de glicosilações. Concluindo, esse trabalho forneceu um banco de dados holístico e abre o caminho para investigações e descobertas de futuros agentes farmacológicos ou alvos na terapia antivenenos.