Estudos genéticos e produção de celulase em Aspergillus niger - Goldman, Gustavo Henrique (1988)
Neste trabalho foram realizados estudos genéticos e verificada a produção de celulase na linhagem industrial, produtora de amilase, de Aspergillus niger NRRL-337, com os seguintes objetivos: isolamento de mutantes auxotróficos e morfológicos nesta Linhagem; verificação da ocorrência do ciclo parassexual; definição de um protocolo eficiente para o isolamento e a regeneração de protoplastos, e, determinação da atividade celulolítica em comparação com o mutante hipercelulolítico Trichoderma reesei QM 9414. Todos os objetivos acima enumerados visaram fornecer subsídios para posteriores estudos da genética básica, bem como para o estabelecimento de um programa de melhoramento genético nesta linhagem. Foram feitas curvas de sobrevivência dos conídios de A. niger para a radiação gama, a luz ultravioleta, o ácido nitroso e o dietilsulfato. Através da irradiação com raios gama foram obtidos sete mutantes morfológicos, onze auxotróficos simples e quinze auxotróficos com dupla deficiência. O rendimento obtido no isolamento total de mutantes auxotróficos foi de 0,52 %, enquanto que no enriquecimento por filtração foi de 2,0 a 4,8 vezes maior. A partir do teste de reversão realizado, verificou-se que os mutantes auxotróficos obtidos demonstraram uma alta estabilidade genética. Com as marcas auxotróficas e morfológicas isoladas, foram feitas tentativas de cruzamento. Obtiveram-se películas heterocarióticas em todos os cruzamentos realizados. Através de diversas metodologias (medição do tamanho de conídios, crescimento em benlate e eletroforese em gel de poliacrilamida com revelação especifica para esterases), não foi possível a definição da ocorrência de diplóides. O protocolo mais eficiente para o isolamento de protoplastos foi obtido a partir da protoplastização do micélio, usando como estabilizador osmótico KCl 0,6 M. Em relação a regeneração, a melhor percentagem foi obtida a partir da protoplastização de tubos germinativos, usando no isolamento como estabilizador osmótico MgSO4 0,5 M e na regeneração MgSO4 0,5 M e Sorbitol 1,2 M. Com o uso de micélio, o número de núcleos por protoplasto não foi superior a dez (com o estabilizador osmótico KCl) ou foi próximo ou superior a dez (com o estabilizador osmótico MgSO4). Os protoplastos isolados a partir do micélio com KCl 0,6 M e armazenados com este mesmo estabilizador a 4°C, apresentaram uma viabilidade de 60 % após 6 dias de armazenamento. A. niger apresentou atividades de beta-glicosidase, carboximetilcelulase, avicelase e papel de filtro modificado similares a da linhagem T. reesei QM 9414. A partir de uma eletroforese em gel de poliacrilamida, com revelação especifica para celulases, constatou-se que a abundância relativa da celulase produzida pela primeira espécie era similar a do mutante celulolítico.