Determinação dos efeitos do silenciamento gênico de proteínas dissulfeto isomerases na colonização de carrapatos e de células embrionárias de carrapatos por Rickettsia rickettsii. - Bibiano, Vitoria Vaz (2023)
Rickettsia rickettsii é o agente etiológico da febre maculosa brasileira (FMB). Após a sua transmissão pela picada de um carrapato infectado, a bactéria infecta as células endoteliais do hospedeiro vertebrado, ocasionando vasculite, cuja evolução é potencialmente fatal. R. rickettsii apresenta transmissão transestadial e transovariana, de forma que a bactéria pode se perpetuar por gerações consecutivas nas populações naturais de carrapatos. Dessa forma, os carrapatos, além de vetores, são considerados reservatórios de R. rickettsii. Os patógenos ingeridos juntamente com a refeição sanguínea chegam primeiramente ao intestino do carrapato, onde precisam resistir aos efeitos de moléculas efetoras do sistema imune. Caso tenham sucesso em evadir ao ataque dos fatores antimicrobianos do intestino, os patógenos precisam migrar para a hemolinfa, onde também sofrem o ataque de reações do sistema imune, e atingir as glândulas salivares. Assim, podem ser transmitidos, via saliva, para um hospedeiro vertebrado sadio em um repasto sanguíneo subsequente. Nesse contexto, compreender as interações entre R. rickettsii e os seus carrapatos vetores é importante, podendo levar à identificação de potenciais alvos para o desenvolvimento de estratégias para o bloqueio da transmissão. No Brasil, o principal vetor de R. rickettsii é o carrapato Amblyomma sculptum [uma espécie do complexo de espécies Amblyomma cajennense]. Especificamente na região metropolitana de São Paulo, a transmissão é dada por Amblyomma aureolatum. Apesar de pertencerem ao mesmo gênero, A. aureolatum e A. sculptum apresentam diferenças marcantes quanto à susceptibilidade à infecção por R. rickettsii, sendo A. aureolatum mais suscetível que A. sculptum. Nosso grupo de pesquisa determinou previamente os efeitos da infecção sobre o perfil de expressão gênica das glândulas salivares de carrapatos A. aureolatum. Dentre as CDSs induzidas pela infecção, destaca-se a CDS de uma proteína dissulfeto isomerase (PDI; Ambaur-64469). As PDIs são proteínas redox da superfamília das tiorredoxinas, sendo necessárias para a correta formação das pontes dissulfeto e dobramento de proteínas no retículo endoplasmático. O silenciamento gênico da PDI Ambaur-64469 por RNA de interferência (RNAi) tornou os carrapatos A. aureolatum mais susceptíveis à infecção. Em A. sculptum, uma PDI similar à CDS Ambaur-64469 foi detectada (AcajSigP-77638). Além disso, análises de RNA-seq evidenciaram outras cinco CDSs de PDIs em A. sculptum, dentre as quais Acaj-77698 e AcajSigP-76333 também possuem os sítios ativos conservados das PDIs. Assim, o presente estudo teve como objetivo principal caracterizar os efeitos do silenciamento gênico de PDIs sobre a infecção por R. rickettsii, utilizando para isso uma linhagem de células embrionárias de A. sculptum (IBU/ASE-16) e carrapatos A. aureolatum como modelo. Primeiramente, foi realizada a determinação da expressão gênica das PDIs AcajSigP-77638, Acaj-77698 e AcajSigP-76333 em células IBU/ASE-16 em resposta à infecção por R. rickettsii. A infecção não afetou a expressão gênica das PDIs em nenhum dos tempos analisados. Além disso, o tratamento das células com dsRNAs específicas para a CDS AcajSigP-77638 levou a uma diminuição significativa em sua expressão gênica, mas não teve nenhum efeito na proliferação de R. rickettsii. Da mesma forma, o silenciamento simultâneo das CDSs AcajSigP-76333 Acaj-77698 e AcajSigP-77638, não alterou a infecção das células IBU/ASE-16. A ausência de uma diferença significativa entre o número de riquétsias nos grupos dsPDI e controle poderia ser atribuída a um possível aumento na expressão de outras CDSs, compensando assim o silenciamento das CDSs AcajSigP-77638, Acaj-77698 e AcajSigP-76333. Nesse sentido, investigamos a expressão gênica das demais CDSs de PDI, AcajSigP-81727, AcajSigP-24920 e Acaj-72396, previamente identificadas no transcriptoma do carrapato A. sculptum. Porém, não foram observadas diferenças significativas na expressão das CDSs de PDI que não foram alvo de silenciamento, sugerindo a inexistência de um mecanismo de compensação. Com o propósito de confirmar os resultados previamente obtidos pelo nosso grupo de pesquisa, a expressão gênica da PDI Ambaur-64469 de A. aureolatum foi silenciada. Assim como anteriormente observado, o número de R. rickettsii foi significativamente maior nas glândulas salivares e no intestino dos carrapatos do grupo ds64469 em comparação com o grupo dsGFP (controle). Em conjunto, os resultados obtidos pelo presente estudo demonstram que as PDIs não estão associadas com o controle da infecção por R. rickettsii em células embrionárias de A. sculptum. Por outro lado, o silenciamento de apenas uma PDI é capaz de elevar os níveis de infecção de carrapatos A. aureolatum por R. rickettsii. Para confirmar que as PDIs, de fato, não exercem um efeito sobre a infecção de carrapatos A. sculptum por R. rickettsii, um experimento similar ao experimento realizado com A. aureolatum deverá ser conduzido.