Especificidade na montagem de filamentos de Septinas: o caso da interface G entre SEPT5 e SEPT8 - Cabrejos, Diego Antonio Leonardo (2016)
Septinas abrangem uma família conservada de proteínas que ligam e hidrolisam GTP e formam heterofilamentos, anéis e redes para realizar as suas funções. Apresentam três domínios estruturais: o domínio N-terminal contendo uma sequência polibásica (para ligar membranas), o domínio de ligação ao nucleotídeo (G) e o domínio C-terminal que inclui uma sequência predita de formar um coiled-coil. Em humanos, as 13 septinas são classificadas em quatro grupos (I, II, III e IV) baseadas nas sequências de aminoácidos. O único filamento caracterizado estruturalmente, até hoje, é o formado por SEPT2-SEPT6-SEPT7, mostrando que as subunidades interagem através de duas interfaces (chamadas G e NC). Os determinantes estruturais da montagem correta do filamento são pouco conhecidos, sendo o estudo limitado pela complexidade em purificar e cristalizar complexos triméricos ou tetraméricos. Uma abordagem alternativa é estudar interfaces individuais de um filamento (G e/ou NC) por separado. Assim, o presente projeto objetivou estudar, utilizando uma abordagem biofísica e estrutural, a interface G formada por SEPT5 e SEPT8 para elucidar os fatores importantes em determinar a sua especificidade. Os domínios GTPase de SEPT5 e SEPT8 foram clonadas em vetor de expressão bicistrônico pET-Duet, co-expressas e co-purificadas. Estudos de análise do estado oligomérico e homogeneidade foram conduzidos utilizando cromatografia de exclusão molecular, espalhamento dinâmico de luz e ultracentrifugação analítica, revelando um complexo dimérico e monodisperso. O complexo apresenta uma mistura aproximadamente equimolar de nucleotídeos (GTP e GDP) ligados enquanto SEPT8(G) sozinha é incapaz de ligar qualquer um dos dois. Além disto o complexo apresenta uma termoestabilidade maior que SEPT8(G), verificado por um aumento em Tm de 5°C. Com o intuito de observar os determinantes estruturais da especificidade, ensaios de cristalização foram conduzidos e assim, cristais do complexo SEPT5-SEPT8(G) que difrataram apenas a muito baixa resolução foram obtidos. Na ausência de uma estrutura cristalográfica, modelagem por homologia foi realizada para analisar as interfaces G entre diferentes combinações de septinas. Identificamos uma interação entre aminoácidos característicos (aminoácidos únicos para cada grupo de septinas) para o complexo formado entre membros do grupo III, (incluindo SEPT5) e membros do grupo II, (incluindo SEPT8). Esta interação entre Phe131 (grupo III) e Thr19 (grupo II) pode explicar a especificidade na formação de uma interface G entre septinas destes grupos durante a formação do filamento e além disso, a importância da presença do GTP ligado ao septina do grupo II. Com isto, propomos pela primeira vez uma explicação plausível da relevância da perda de atividade catalítica das septinas deste grupo, um fato inexplicado até o momento. Mutação dos resíduos identificados levou a uma mudança no seu perfil de eluição do complexo durante purificação por exclusão molecular indicando alterações na formação do complexo mutante.