Avaliação da sensibilidade do ensaio de qPCR com o alvo 18s rDNA em amostras de sangue e biópsias de pacientes com leishmaniose cutânea e mucocutânea de região endêmica - Castanheira, Gabriel Victor (2024)
Introdução: A leishmaniose tegumentar americana (LTA), uma doença infecciosa, não contagiosa, de transmissão vetorial com ciclo heteroxênico é causada pelo protozoário flagelado pertencente ao gênero Leishmania, que acomete pele e mucosas. O parasita apresenta duas formas evolutivas: promastigota, que é a forma flagelada e amastigota que é a forma aflagelada intracelular. Tem como reservatórios marsupiais, tamanduás, canídeos, roedores e primatas. O vetor da doença é o inseto do gênero Lutzomyia conhecido como mosquito palha. A doença compreende um espectro de variações clínicas, que depende da espécie de Leishmania que está causando a infecção, do sistema imunológico do indivíduo e fatores epidemiológicos. Das variações nas características clínicas, a LT é dividida da seguinte forma: Leishmaniose cutânea localizada (LCL), leishmaniose cutânea difusa (LCDf); leishmaniose cutânea disseminada (LCDs); leishmaniose mucocutânea (LMC); leishmaniose difusa (LD) e leishmaniose difusa disseminada. O diagnóstico pode ser feito por imprint do fragmento da lesão em lâmina para coloração e observação microscópica, cultura e por técnicas moleculares que possuem alvos específicos. O tratamento é feito com medicamentos antiparasitários como a Anfotericina B. Um diagnóstico precoce e menos invasivo a partir de amostras sanguíneas pode ser útil em vez das biópsias das lesões que podem causar um certo incomodo ao paciente. Portanto a PCR é fundamental na detecção e quantificação da carga parasitária. A quantificação da carga parasitária é uma estratégia de monitoramento da doença antes e durante o tratamento dos pacientes baseados nas condições diagnóstica desse método. Objetivos: Padronizar a cPCR e qPCR utilizando o alvo 18s rDNA; determinar a sensibilidade da técnica qPCR com o alvo 18s rDNA em amostras de sangue e tecido de pacientes com suspeita de leishmaniose cutânea e mucocutânea; avaliar a sensibilidade das cPCR em amostras de sangue e tecido com os alvos kDNA e 18s rDNA; avaliar a sensibilidade da qPCR in house com o alvo 18s rDNA em paralelo com o kit comercial da Viasure. Metodologia: O projeto teve início após aprovação da Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq). Foram utilizadas amostras do ambulatório de Leishmanioses da Divisão de Clínica de Moléstias Infecciosas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo e do Centro de Pesquisas em Doenças infecciosas e Parasitárias do Hospital Universitário Clemente Faria, localizado em Montes Claros (MG). O número de pacientes incluídos no projeto foi um total de 46 (n=46) dos quais foram coletados dois tipos de amostras, pareadas e não pareadas; uma de sangue periférico em tubos com EDTA, biópsias cutâneas ou mucocutâneas. Essas amostras foram submetidas aos ensaios de cPCR e PCR Real-Time Sybr Green e posteriormente armazenadas no BIOBANCO do Instituto de Medicina Tropical. Foram descritos os resultados das padronizações para cada diluição com uso de médias, desvio padrão (DP) e coeficiente de variação (CV); os sexos dos pacientes foram descritos com uso de frequências absolutas e relativas e as idades e número de lesões foram descritos com uso de medidas resumo (média, desvio padrão, mediana e quartis). Os resultados dos Cts das amostras dos pacientes foram descritos com uso de medidas resumo e comparados entre cada tipo de amostra com uso de equações de estimação generalizadas (EEG) com distribuição normal e função de ligação identidade, assumindo matriz de correlações permutável entre as amostras (McCullagh e Nelder, 1989). A análise foi seguida de comparações múltiplas de Bonferroni para identificar as diferenças encontradas (Neter, et. al., 1996). Resultados da concordância da qPCR com o alvo 18s rDNA com os três tipos de amostras, positivas e negativas, em relação à triagem foi de 65,7% no sangue, 24,4% no sangue-guanidina e tecido 43,2%. Já no que diz respeito à sensibilidade, as amostras de sangue apresentaram um melhor percentual (69,2%) em relação ao tecido (50%) e sangue-guanidina (31,3%). Quanto aos verdadeiros positivos (VPP), as amostras de tecido apresentaram um percentual de probabilidade dos indivíduos estarem doentes de 87,5%, enquanto no sangue foi de 78,3%. Conclui-se então que o alvo 18s rDNA é um marcador eficaz com alta sensibilidade na detecção em sangue periférico, podendo ser utilizado tanto para pesquisa como para diagnóstico