Perfil de expressão dos circRNAS no câncer colorretal - Freitas, Vanessa Galdeno (2022)
Os RNAs circulares (circRNAs) são uma nova classe de RNA que forma laços (loops) contínuos fechados covalentemente. Como os RNAs longos e não codificadores, as funções efetivas dos circRNAs dependem principalmente das características de suas sequências e estruturas e há um crescente corpo de papéis funcionais atribuídos aos circRNAs. Por exemplo, os circRNAs atuam como esponjas de microRNAs que modulam indiretamente a expressão gênica de genes codificadores de proteínas. Além disso, a desregulação da expressão de circRNAs têm sido associada a várias patologias humanas, como o câncer. Em termos de expressão, estudos relataram centenas de circRNAs como mais abundantes do que seus correspondentes mRNAs lineares, não apenas nos tecidos, mas também no sangue. O câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais diagnosticado e a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer no mundo. Estudos em linhas de células CRC e tecidos CRC mostram uma redução geral na abundância de circRNA em comparação com tecidos saudáveis, permitindo que as células CRC sejam inesperadas e apresentem proliferação descontrolada, por exemplo. Metodologia: Caracterizamos e estudamos o perfil de expressão dos circRNAs em linhagens de células CRC com o objetivo de entender melhor o papel desses RNAs na tumorigênese e progressão do câncer. Primeiro, os dados de sequenciamento de RNA (RNA-seq) de duas linhas celulares comerciais do mesmo paciente primário e metastático de CRC (SW480 e SW620, respectivamente) foram obtidos a partir de uma plataforma Illumina NextSeq. Em seguida, foram utilizados dois métodos de preparação da biblioteca de sequenciamento de RNA: i) o protocolo padrão sugerido por Illumina; ii) e um protocolo interno para melhorar a detecção de circRNAs. Finalmente, todos os dados de RNA-seq foram alinhados ao genoma de referência (GRCh38) e usados como entrada para identificar circRNAs por meio do algoritmo CircExplorer e outros pipelines de computação internos. As metodologias RSEM e Kallisto também foram usadas para gerar o perfil de expressão gênica de todas as linhagens celulares e preparações de bibliotecas. O pacote do R, edgeR, foi utilizado para normalização e seleção dos genes diferencialmente expressos. Resultados: Nossos resultados mostraram que nosso protocolo interno de preparação da biblioteca de sequenciamento de RNA detectou 70% mais circRNAs do que uma preparação padrão comumente usada. Em seguida, avaliando o número de circRNAs expressos nas linhagens celulares primária (SW480) e metastática (SW620), encontramos 3.991 circRNAs expressos diferencialmente (únicos, FDR <0,05; log2 fold change> 2 ou <-2), 1.936 e 2.055 circRNA super e sub expressos, respectivamente, na linhagem de tumor primário versus a metastática. Ao avaliar as vias celulares dos genes que geram circRNAs, identificamos vários candidatos envolvidos na tumorigênese e na progressão do câncer por vias epigenéticas, mas também, diversos circRNAs que parecem estar agindo em mecanismos e vias de supressão tumoral, em ambas as linhagens. Portanto, em resumo, este trabalho traz contribuições importantes para entendermos melhor o papel dos circRNAs no câncer colorretal e também suas contribuições na progressão tumoral de tumor primário à metástase, e como eles podem ser importantes como biomarcadores para essa patologia.