Purificação e caracterização de peptídeos presentes nos venenos de serpentes africanas: à procura de inibidores de peptidases de importância médica - Kodama, Roberto Tadashi (2019)
As peptidases desempenham um papel importante para o bom funcionamento fisiológico dos mais diversos organismos. Quando desreguladas, estão associadas a patologias, por exemplo, a atividade exacerbada da elastase-1 está relacionada à pancreatite, e, da catepsina L, está envolvida na metástase de tumores. Portanto estas peptidases se tornaram potenciais alvos terapêuticos, no que se refere à procura por inibidores. O veneno de serpentes é composto por misturas complexas de moléculas que podem apresentar as mais derivadas funções, inclusive a inibição de enzimas. Tendo isto em vista, este trabalho teve como objetivo, purificar, caracterizar e estudar in vitro e in silico novos inibidores presentes nas porções de baixa massa molecular dos venenos de três gêneros de serpentes africanas, Naja, Dendroaspis e Bitis. Para isso, as porções de baixa massa molecular (<10 kDa) de cada veneno foram submetidas a uma cromatografia por RP-HPLC usando uma coluna C18. As frações foram coletadas e um screening, utilizando substratos FRET, foi feito para verificação da inibição sobre as peptidases estudadas neste trabalho. A identificação das frações de interesse foi realizada por espectrometria de massas, dentre as sequências obtidas, moléculas da classe das three-finger-toxins foram identificadas, e, pela primeira vez descritas como inibidores de peptidases. Outras moléculas, da classe dos Kunitz, que foram anteriormente descritas como bloqueadores de canais de Na+ e K+, também foram identificadas. O peptídeo DPSA8 (do veneno de Dendroaspis polylepis) se destacou por apresentar inibição semelhante da catepsina L e da elastase-1 no teste de screening. Este peptídeo, classificado como Kunitz, foi caracterizado como um inibidor acompetitivo para a elastase-1, com um Ki de 8 &#181M. A análise por ancoramento (ZDOCK) indicou modelos de interação deste peptídeo com a elastase-1, dentre estes modelos foram mostradas interações no sítio catalítico e em outras regiões da enzima. Utilizando estes modelos de interação, dois peptídeos foram desenhados para serem estudados quanto à possível inibição da elastase-1 e da catepsina L. O primeiro não apresentou atividade inibitória, entretanto, o segundo, um peptídeo cíclico nomeado PEP2 (contendo 30 resíduos de aminoácido), mostrou ser um inibidor competitivo, com Ki de 1,96 µM sobre a catepsina L. Além disso, foi realizada a análise de ancoramento dos BPPs, do veneno de Bitis spp, usando a ECA (enzima conversora de angiotensina I) como receptor. Estes resultados mostraram uma alta relação dos scores obtidos nos estudos in silico com os Kis obtidos e já publicados. Este trabalho descreve algumas toxinas de baixa massa molecular com a função inibitória de peptidases, isso pode contribuir para um entendimento maior do processo de envenenamento. Em adição, foi empregado o método de ancoramento molecular para o desenho de novas moléculas inibidoras, resultando no PEP2, um peptídeo capaz de inibir a atividade da catepsina L com uma baixa constante de inibição. Mostrando mais uma vez que esta metodologia pode contribuir para a procura de novas entidades biotecnológicas.