Produção de L-asparaginase extracelular por fermentação em estado sólido - Cachumba, Jorge Javier Muso (2017)
A L-asparaginase (EC 3.5.1.1) é a enzima responsável pela hidrólise da L-asparagina em ácido L-aspártico e amônia, sendo utilizada como agente antitumoral e também para reduzir o conteúdo de acrilamida, composto neurotóxico e carcinogênico, presente em certos alimentos processados a altas temperaturas. Atualmente, o número de trabalhos referentes à produção de L-asparaginase por leveduras e fungos é limitado, principalmente quanto à produção da enzima de forma extracelular em fermentação em estado sólido (FES). Assim, o presente trabalho visou avaliar a produção de L-asparaginase extracelular por FES utilizando fungos e leveduras. Foi avaliado um grupo de 10 cepas de microrganismos como potenciais produtores de L-asparaginase extracelular. Na FES empregou-se o bagaço de cana-de-açúcar (80% de umidade relativa) como suporte suplementado com meio Czapek-Dox modificado e essas foram realizadas em frascos Erlenmeyer de 50 mL a 30 °C por 72 horas para leveduras e 96 horas para o fungo A. terreus. A atividade enzimática foi determinada pela metodologia do hidroxamato e confirmada por testes de cromatografia em camada delgada. Após a seleção dos microrganismos produtores de L-asparaginase extracelular, foi testada a influência de diferentes fontes de carbono, fontes de nitrogênio, pH, tamanhos de partícula e temperaturas na produção de L-asparaginase extracelular por FES utilizando um arranjo ortogonal Taguchi L\'16. Após essa etapa de seleção das variáveis foram realizados ensaios visando a otimização do processo, avaliando o efeito da concentração da fonte de carbono e nitrogênio por planejamento composto central rotacional (DCCR) 24. Finalmente, e com as melhores condições, avaliou-se a produção de L-asparaginase em reator em coluna de leito fixo com volume de 180 mL. Dos microrganismos testados na etapa de seleção, o fungo filamentoso Aspergillus terreus CCT7693 demostrou resultados positivos de atividade asparaginolítica, sendo este selecionado para os experimentos posteriores. De acordo com o arranjo ortogonal Taguchi L\'16, a maior produção de L-asparaginase extracelular (112,57 ± 13,65 U/L) foi obtida quando a maltose foi utilizada como fonte de carbono; a glutamina como fonte de nitrogênio (indutor); pH de 5,5; tamanho de partícula inferior a 0,850 mm e temperatura de 25 °C. No DCCR foram determinadas como condições otimizadas uma concentração de amido de 0,54%; ausência de maltose; concentração de L-asparagina de 0,44% e concentração de L-glutamina de 1,14%, obtendo-se uma atividade L-asparaginase máxima de 120,732 ± 16,77 U/L atingindo uma produção 7,39 vezes superior àquela obtida inicialmente (16,34 ± 3,28 U/L). Na etapa de produção da enzima em reator em coluna de leito fixo obteve-se uma atividade enzimática máxima total de 105,3 U/L demonstrando que este novo modo de produção utilizado foi eficaz. Assim, o presente trabalho permitiu avaliar aspectos relacionados com as condições de cultivo e selecionar o fungo Aspergillus terreus CCT7693 como microrganismo produtor de L-asparaginase extracelular por FES, abrindo perspectivas para explorar este sistema visando aumento de escala de produção.