Regulação da expressão dos genes TSC1 e TSC2 na via de mTORC1 - Conceição, Fábio Arthur Mateus (2024)
O complexo da esclerose tuberosa (TSC, do inglês, tuberous sclerosis complex) é uma doença sistêmica, caracterizada por tumores benignos em diferentes órgãos e causada por variantes patogênicas nos genes supressores de tumores TSC1 ou TSC2. As proteínas TSC1 e TSC2 inibem a via de mTORC1, central no controle do crescimento e proliferação celular. A atividade de mTORC1 tem sido relacionada à expressão diferencial de determinados genes. Contudo, não é conhecido se a atividade da via tem algum efeito sobre a quantidade de RNAm e proteína expressos pelos genes do complexo TSC (TSC1, TSC2 e TBC1D7). A proteína unkempt (UNK), codificada pelo gene UNK, é ligante de RNA e regula a expressão de RNAm, em processos de diferenciação neuronal, como parte constituinte de mTORC1. Resultados anteriores do nosso laboratório identificaram a co-expressão do RNAm de TSC1 e UNK em tumores sem alterações patogênicas em TSC1 e TSC2. Pouco se conhece sobre a regulação da expressão dos genes TSC1 e TSC2 na modulação da atividade da via de mTORC1, tampouco se UNK regula a expressão de RNAm de genes dessa via. Objetivos: Os objetivos deste trabalho foram avaliar: (i) o(s) efeito(s) da via de mTOR sobre a quantidade de RNAm e proteínas expressos pelos genes TSC1, TSC2, TBC1D7 e UNK; e (ii) se o silenciamento de UNK por shRNA altera a quantidade das proteínas TSC1 e TSC2 em HEK293T. Métodos: Análises de expressão gênica diferencial foram realizadas em dados de transcriptomas, publicamente disponíveis, obtidos de linhagens celulares HEK293T tratada com rapamicina, SH-SY5Y com knocking down de UNK ou de músculo sóleo de camundongos que haviam sido tratados com rapamicina ou restrição calórica por 15 meses. No laboratório, HEK293T foi tratada com rapamicina por 24 horas. Foi estabelecida uma linhagem celular por transdução de partículas lentivirais modificadas para expressão de shRNA (short-hairpin RNA) para silenciamento de UNK. Análise proteica em blot foi realizada para comparação quantitativa das proteínas-alvo. Resultados: HEK293T submetida à repressão da via de mTORC1 por rapamicina apresentou, após 72 horas, aumento da quantidade de RNAm de TSC2. Os dados de transcriptoma de músculo sóleo de camundongos tratados in vivo por 15 meses com rapamicina revelaram aumento da quantidade de RNAm de Tsc2 e redução do RNAm de Tsc1 e Tbc1d7. Na linhagem humana SH-SY5Y que sofreu knocking down de UNK houve redução do RNAm de TSC2. O estudo das proteínas do complexo TSC1-TSC2-TBC1D7 em linhagem HEK293T não modificada mostrou aumento do nível de UNK 24 horas após carenciamento, que foi mantido durante tratamento consecutivo com rapamicina por mais 24 horas. Foi gerada uma linhagem de HEK293T em que a proteína UNK foi significantemente reduzida. Nela, não se observou alteração da quantidade de nenhuma das três proteínas do complexo TSC1-TSC2-TBC1D7. Conclusões: Nossos dados indicam que a via de mTORC1 tem efeito negativo sobre a quantidade de RNAm de TSC2 em HEK293T e músculo sóleo de camundongo. Em HEK293T, a inatividade da via de mTORC1 aumenta o nível da proteína UNK. A redução da proteína UNK nessa linhagem celular não altera a quantidade das proteínas do complexo TSC1-TSC2-TBC1D7. Em linhagem celular SH-SY5Y, a redução de UNK diminui a quantidade de RNAm de TSC2, corroborando o efeito negativo de mTORC1 observado sobre esse RNAm. Limitações: O estudo tem as limitações de não ter testado alterações da quantidade de RNAm nem ter avaliado o efeito da inibição da via de mTORC1 na linhagem celular geneticamente modificada (shRNA para UNK). Logo, a linhagem celular estabelecida neste projeto de pesquisa será valiosa para se testar o modelo em que a atividade de mTORC1 reduz a quantidade do RNAm de TSC2 e se essa regulação depende de UNK.