O sequenciamento de RNA de células únicas (scRNA-seq) evidencia que o gene Aire influi na heterogeneidade de células epiteliais tímicas medulares, mas não na sua diferenciação funcional - Mascarenhas, Romário de Sousa (2024)
A tolerância imunológica central é controlada principalmente pelo gene Autoimmune regulator (Aire), que atua nas células epiteliais tímicas medulares (mTEC), promovendo a expressão e a apresentação dos antígenos restritos aos tecidos (TRAs) em um processo denominado Expressão Gênica Promíscua (PGE). Aire é um gene pleiotrópico, e mutações nesse gene estão associadas a diversas desordens no sistema imunológico, incluindo a perda da tolerância imunológica e o desenvolvimento da Síndrome Autoimune Poliglandular do tipo 1 (APS-1). A forma clássica dessa síndrome rara tem padrão de herança autossômica recessiva; no entanto, a literatura também destaca a existência de uma forma não clássica da APS-1, com padrão de herança autossômica dominante, em que mutações heterozigotas no gene Aire resultam em manifestações clínicas da síndrome. Assim, investigamos como essas mutações heterozigóticas afetam a biologia e a diversidade das mTECs, visando entender o papel de Aire na heterogeneidade e na diferenciação funcional dessas células. Nesse contexto, utilizou-se o sistema de edição gênica CRISPR/Cas9 para induzir mutações no éxon 6 do gene Aire em células mTEC 3.10, e posteriormente, os clones mutantes obtidos foram submetidos ao sequenciamento de RNA de células únicas (scRNA-seq). Identificou-se a deleção de uma guanina (G) na posição 735 em um dos alelos de Aire (c.735delG), o que alterou a matriz de leitura do éxon 6, resultando em uma proteína truncada com 243 aminoácidos, sem comprometer as possíveis regiões off-target. Na análise de scRNA-seq, foi possível elucidar a diferenciação funcional das mTECs 3.10 in vitro, destacando que tanto as células wild-type (WT) quanto as células mutantes (CS8D6) se subdividem em três subpopulações: mTECs tradutoras, intermediárias e apresentadoras. No entanto, observou-se que a mutação heterozigótica foi suficiente para perturbar a expressão gênica e as funções da proteína AIRE. Além disso, notou-se que a mutação c.735delG impactou a proporção, o ciclo e o metabolismo celular. As células mutantes também apresentaram redução na expressão dos genes que codificam proteínas parceiras de AIRE, bem como hipoexpressão global dos genes diferencialmente expressos, incluindo genes de TRAs. A análise da trajetória do RNA mostrou que, apesar da diferenciação funcional ser a mesma nas células WT e CS8D6, o modelo mutante alterou a trajetória temporal de expressão de genes fundamentais para as células mTECs, incluindo genes de adesão, migração, fatores de transcrição e genes do complexo de histocompatibilidade principal. A caracterização por meio de scRNA-seq evidenciou, portanto, a diversidade das mTECs e o impacto da mutação c.735delG no transcriptoma dessas células, destacando que Aire atua na regulação da heterogeneidade, sem afetar a trajetória de diferenciação funcional. Conjuntamente, os resultados reforçam a importância do estudo de mutações heterozigóticas no gene Aire e da caracterização das mTECs a nível de células únicas, visto que essa abordagem permite uma compreensão abrangente acerca diversidade celular e da dinâmica molecular evolvida na regulação da tolerância imunológica central.