Análise citológica de calos e plantas regeneradas in vitro de variedades de cana-de-açúcar (Saccharum spp) - Silvarolla, Maria Bernadete (1990)
As variedades de cana-de-açúcar em cultivo, caracterizam-se por apresentarem cromossomos pequenos e em número elevado. Estas características dificultam a determinação segura do número de cromossomos das variedades, sendo comuns referências a mosaicismo cromossômico. Dessa maneira, torna-se necessário estabelecer metodologias específicas para a obtenção das preparações e critérios para sua avaliação, de modo a se distinguir a variação real daquela devida a erros de interpretação. Neste estudo analisaram-se plantas regeneradas in vitro quanto ao número de cromossomos, comparativamente às respectivas variedades doadoras, que também foram avaliadas acerca de sua estabilidade cromossômica. Foram testadas metodologias para a obtenção de preparações onde os cromossomos metafásicos estivessem nítidos, dispersos e contidos em células intactas, baseadas na utilização de pré-tratamentos com inibidores do fuso mitótico e de síntese proteica, isolados ou combinados, bem como no emprego de maceração enzimática. Além das distribuições de frequências de contagens dos números de cromossomos, foi estabelecido ainda, um critério para a seleção das metáfases segundo sua qualidade, de modo a se obter uma avaliação confiável do número de cromossomos. Deste modo verificou-se que as variedades doadoras, POJ2878, NA56-79, Co4l9, IAC68-l2 e IAC68-l44, nas condições do presente estudo, não apresentaram mosaicismo cromossômico, tendo respectivamente, 118, 114, 113, 112 e 115 cromossomos. Os subclones analisados citologicamente foram obtidos pela regeneração de calos obtidos a partir de dois tipos de explantes, cultivados por períodos variáveis, em meios de cultura sólidos contendo 2,4-D. Entre os quatorze subclones analisados quanto ao número de cromossomos, treze apresentaram as maiores frequências de metáfases de melhor qualidade coincidentes com o número de cromossomos obtido por sua respectiva variedade doadora, não se detectando variação quanto ao parâmetro avaliado. Apenas um subclone, derivado da variedade NA56-79, aparentou ser portador de certa instabilidade cromossômica. Os agentes de pré-tratamento testados para as doadoras e maioria dos subclones, somente se mostraram eficientes na obtenção de metáfases com cromossomos dispersos e nítidos, quando utilizados de forma a conjugar a ação do inibidor de síntese proteica, cicloheximida e um dos inibidores de fuso, 8-hidroxiquinolina ou 1-bromonaftaleno. Para a obtenção de metáfases contidas em células intactas teve fundamental importância a maceração enzimática. Na tentativa de se dispor de um marcador citológico auxiliar na identificação de variantes somaclonais foram testadas duas metodologias de bandamento NOR nas variedades NA56-79, IAC68-12 e IAC68-144. Verificou-se que, apesar de um dos métodos ter produzido bandas NOR, a qualidade das metáfases não foi satisfatória indicando a necessidade de adequações para se obter um padrão nítido de bandas NOR em cana-de-açúcar. Assim, foi possível somente a avaliação preliminar do número de nucleólos presentes em núcleos interfásicos, a qual indicou 1 a 9 nucléolos por célula. Visando futuras análises citológicas na fase de calo, realizou-se o estudo histológico de calos de diferentes subculturas em presença de 2,4-D e também uma observação da fase de regeneração (6-BA). No que se refere aos calos mantidos em 2,4-D verificou-se que a proliferação celular que resultou na formação dos calos ocorreu a nível dos feixes vasculares, compondo-se de células de aspecto meristemático com alto índice mitótico. Estas regiões situavam-se mais internamente no calo até aproximadamente 6 meses de cultura, sugerindo amostragens internas para a obtenção de maior número de divisões. Posteriormente, as regiões mais internas passaram a ser constituídas de células onde não se observaram divisões celulares, resultando então, numa inversão das regiões de coleta, que seriam mais externas, onde ocorreram células com aspecto meristemático e/ou parenquimático. Quanto aos calos em meio de regeneração não foi possível definir claramente as regiões ideais de coleta nem ainda se a morfogênese se processava via organogênese ou embriogênese somática, embora os calos evidenciassem potencial morfogenético