Capacitação espermática e sua relação com o perfil de microRNAs espermáticos e fertilidade em touros Nelore - Oliveros, Laura Nataly Garcia (2024)
A capacitação espermática é chave para o sucesso da fecundação e envolve eventos celulares e moleculares. Embora apresentem destacada função na regulação molecular da fertilidade em bovinos, os microRNAs espermáticos possuem papel desconhecido na regulação da capacitação espermática. Assim, esta tese busca compreender a relação entre os diferentes eventos da capacitação espermática e a fertilidade de sêmen criopreservado de touros da raça Nelore, bem como identificar microRNAs relacionados a estes eventos que possam ser biomarcadores. Para tal, foram realizados três estudos. O primeiro estudo avaliou a eficiência de técnicas para detectar eventos relacionados à capacitação espermática e diferenciar das crioinjúrias assim como, selecionar e categorizar os touros como de alta e baixa responsividade à capacitação espermática. Para isso, três ejaculados de doze touros (n=36) foram colhidos e divididos nos grupos controle (CO) e capacitado (CAP: espermatozoides frescos induzidos à capacitação in vitro, com incubação a 38,5ºC, 5% de CO2 por 1 h em meio de capacitação). Todas as amostras foram analisadas quanto à volume, concentração e cinética espermática e aos eventos da capacitação espermática (desorganização dos fosfolipídeos de membrana plasmática, susceptibilidade da membrana plasmática à peroxidação lipídica, efluxo de colesterol, translocação da fosfatidilserina, reação acrossomal e potencial de membrana mitocondrial). Após estas análises, o sêmen foi submetido a criopreservação, descongelado e novamente divido em grupos controle (CRICO) e capacitado (CRICAP: induzidos à capacitação in vitro). E, submetido às mesmas análises espermáticas. Como principais resultados, notou-se que a capacitação espermática reduziu VCL e aumentou: STR, translocação da fostatidilserina, distribuição espacial do colesterol, membrana plasmática intacta e acrossomo reagido, independentes da criopreservação. Baseados nos resultados dos eventos da capacitação espermática, os touros foram classificados como de alta (HrC) e baixa (LrC) resposta à indução da capacitação. Esta classificação mostrou o sucesso da análise da fosfatidilserina e reação acrossomal em caracterizar uma amostra capacitada e diferenciá-la das crioinjúrias. O segundo buscou compreender a relação entre a capacitação espermática e o perfil de miRNAs espermáticos em sêmen fresco e criopreservado de touros de alta e baixa responsividade à capacitação espermática. Foram utilizados três ejaculados do sêmen fresco e pós- criopreservado de oito touros classificados (no estudo 1) como de alta responsividade (HrC, n=4) e baixa responsividade (LrC, n=4) à capacitação espermática. Tanto o sêmen fresco, quanto o pós-criopreservação foram avaliados quanto aos eventos da capacitação espermática e, ao perfil de microRNAs, as diferenças entre os eventos foram calculadas e comparadas entre os grupos HrC e LrC. Sete miRNAs foram encontrados exclusivamente em amostras capacitadas do sêmen fresco (bta-miR-125b, -182, -200b, -25, -22-3p, -433 e 760-3p). Um miRNA foi exclusivo no grupo HrC (bta-miR-191) e dois exclusivos no grupo LrC (bta-miR- 106a e -18a) de sêmen criopreservado. O terceiro estudo buscou compreender a relação entre a capacitação espermática, os miRNAs e a fertilidade de sêmen comercial de touros. Neste estudo, foram utilizadas 3 partidas de sêmen de 18 touros da raça Nelore, sendo 10 de alta fertilidade (HF) e 8 de baixa fertilidade (LF). Cada partida foi avaliada quanto aos eventos da capacitação espermática e com base nos resultados, os touros foram classificados como de alta responsividade (HrC) e baixa responsividade (LrC) à capacitação espermática. Foram selecionados 5 touros de HrC e alta fertilidade (HF-HrC) e 4 touros de LrC e baixa fertilidade (LF-LrC). Em seguida, os espermatozoides dos touros HF-HrC e LF-LrC foram analisados quanto à expressão de miRNAs (selecionados no estudo 2) nos grupos controle e capacitado. Doze miRNAs (bta-miR-18a, -25, 125b, -129-5p, -132, -191, -200b, - 320a, -335, -375, -574, - 1246) foram relacionados com eventos de capacitação espermática e, diferentemente expressos em touros de alta e baixa fertilidade. Assim, é possível concluir que as técnicas de detectação do efluxo de colesterol e da reação acrossomal, foram mais efetivas em marcar a diferença entre os eventos da capacitação e os efeitos deletérios da criopreservação. Também, conclui-se que os touros e por extensão, seus espermatozoides, respondem diferentemente à capacitação espermática, evidenciada pelos miRNAs expressos exclusivamente no sêmen criopreservado de touros de alta e baixa responsividade à capacitação espermática, sendo o miRNA bta-miR- 191 um possível biomarcador. Semelhantemente, a técnica de translocação de fosfatidilserina, foi mais eficiente no grupo HrC em touros de alta e baixa fertilidade.