O papel de lipídios oxidados e surfactantes como promotores de agregados proteicos tipo amilóide - Campos, Gustavo Scanavachi Moreira (2019)
Esta tese de doutoramento aborda (i) a formação de agregados proteicos de albumina de soro bovina (BSA) induzida pela ação de sufactantes aniônicos, (ii) o impacto da presença de lipídeos oxidados em membranas, e (iii) a indução de formação de fibra amiloide do polipeptideo das ilhotas humano (IAPP) por membranas miméticas. As principais técnicas utilizadas foram espalhamento de raio-X a baixos ângulos (SAXS) e fluorescência. Determinamos por SAXS que a adição de SDS ou SPFO em solução de BSA, pH 3.7, induz a formação de agregados que são maiores na presença do SDS. Estes resultados foram confirmados por medidas de turbidez e de microscopia eletrônica. Em paralelo, medidas de dicroísmo circular e fluorescência do Th T indicaram presença maior de folhas b nos agregados induzidos por SPFO. Assim sendo, sugerimos que o SPFO é mais eficiente em induzir agregados do tipo amilóide em BSA devido a sua estrutura ser mais rígida do que a do SDS, restringindo assim o movimento das cadeias polipeptídicas da BSA e favorecendo a formação de estruturas ordenadas. Em termos do impacto de lipídeos oxidados em membranas miméticas, estudamos membranas compostas por diferentes razões molares POPC:lipídeo oxidado à temperatura de 23oC e 37oC. Os lipídeos oxidados foram: POPC hidroperoxidado (POPC-OOH) e lipídeos de cadeia alquila oxidadas encurtadas PAZEPC e POVPC, que possuem grupos carboxila e aldeído no terminal das cadeias, respectivamente. Para membranas contendo POPC-OOH, os resultados de anisotropia resolvida no tempo da sonda TMA-DPH, de TRES da sonda laurdan e dos perfis de densidade eletrônica (½(r)) obtidos a partir das análises de SAXS, indicam que o grupo OOH do lipídeo oxidado POPC-OOH está localizado na região da interface membrana/solvente. Com o aumento da concentração do POPC-OOH na membrana lipídica, há diminuição da anisotropia residual (r1) e do tempo de vida de fluorescência do TMA-DPH sugerindo um aumento progressivo na penetração de água na interface da membrana e/ou a interação da sonda com o grupo OOH do lipídeo oxidado. De maneira interessante, os perfis de densidade eletrônica das membranas POPC:POPC-OOH apresentam um decréscimo na espessura da bicamada lipídica com aumento da quantidade de POPC-OOH na membrana, acompanhado de um aumento de densidade eletrônica na região dos grupos CH2. As análises das funções de correlação vertical (perpendicular à superfície da membrana) de vesículas multilamelares, obtidas dos experimentos de SAXS, revelaram um aumento da flutuação da membrana e diminuição do módulo de curvatura (KC) de cerca de 5 x 10-20 J para membranas compostas por POPC para 1 x 10-20 J para membranas contendo POPC-OOH. A presença dos lipídeos oxidados PAZEPC e POVPC induziu aumento no grau de hidratação na interface da membrana, como inferido pelas análises dos espectros de fluorescência. Não foi possível obter uma clara indicação da localizacão dos grupos oxidados de PAZEPC e POVPC na membrana. Além disso, a introdução do PAZEPC e POVPC nas membranas de POPC induziu decréscimo de correlação entre as bicamadas lipídicas observadas por SAXS, extinguindo-se em membranas contendo 25% de PAZEPC. Sendo assim, estes dois lipídeos devem aumentar expressivamente a flutuação da membrana impedindo seu empilhamento. Além disso, a presença do PAZEPC pode também induzir carga na superfície de membrana dificultando a formação de MLVs. Por fim, os resultados de cinética de fibrilação de IAPP mostraram que as membranas compostas por lipídeo aniônico POPS aceleram o processo de formação da fibra amiloide na razão molar 10:1 (lipídeo:IAPP), com desaceleração para razões molares superiores. Entretanto, os mesmos experimentos realizados com as membranas oxidadas, caracterizadas neste trabalho, foram inconclusivos, pois não obtivemos reprodutibilidade nos resultados.