Expressão e purificação de enzimas xilanolíticas recombinantes e estudo de suas atividades contra arabinoxilanas extraídas da cana de açúcar - Garbelotti, Carolina Victal (2022)
O Brasil possui grande força na agricultura, com a região de Ribeirão Preto sendo tradicional no cultivo de cana de açúcar. A procura por fontes alternativas de energia que sejam mais sustentáveis e renováveis têm encorajado estudos focados na obtenção de biocombustíveis e outros químicos de maior valor agregado derivados da hidrólise da biomassa lignocelulósica. Com este objetivo, enzimas ativas em carboidratos têm atraído atenção por poderem hidrolisar de forma específica e mais sustentável, evitando geração de resíduos químicos e subprodutos indesejados. Porém, a recalcitrância da parede celular vegetal têm sido um obstáculo para a aplicação industrial da hidrólise enzimática e, para superá-lo, é necessário melhor compreensão as estrutura da parede celular da planta, pré-tratamentos eficientes da biomassa e coquetéis enzimáticos otimizados. Neste trabalho, estudamos a hidrólise enzimática de três frações arabinoxilanas extraídas do colmo da variedade de cana de açúcar SP80-3280 por deslignificação com clorito de sódio apenas, ou com tratamento adicional alcalino ou com DMSO. Combinações de enzimas hemicelulolíticas recombinantes incluíram as glicosil hidrolases xilanases GH10 e GH11, arabinofuranosidase GH43 e α-glucuronidase GH67, junto de uma acetil xilano esterase CE4 e uma feruloil esterase CE1. Análises de açúcares redutores do hidrolisado foram correlacionadas com cromatografia líquida de interação hidrofóbica acoplada a espectrometria de massas e ferramentas de análise de metabolômica. Foi observado que os arabinoxilanos extraídos por métodos diferentes têm organização e estrutura diferentes, resultando em alterações nos perfis de digestão enzimática e nos produtos de hidrólise. O arabinoxilano extraído por tratamento alcalino foi o mais acessível à hidrólise completa por este conjunto de enzimas quando comparado com os polissacarídeos mais recalcitrantes dos extraídos com clorito e DMSO. Além disso, ensaios de combinações enzimáticas com as quatro hidrolases e acetil xilano esterase, apesar de não mostrarem sinergia, mostraram cooperatividade entre as enzimas acessórias e as xilanases. Como não houve comprovação da presença de decorações fenólicas nos arabinoxilanos extraídos, foi feita caracterização bioquímica e biofísica da enzima feruloil esterase, que demonstrou atividade ótima a 60°C e pH 6,5 e eficiência catalítica por volta de 390 s -1.mM-1 contra o substrato sintético etil ferulato. A enzima se mostrou estável e ativa também contra oligossacarídeos do arabinoxilano de farelo de trigo ramificados com grupos ferulato, com grande potencial para uso industrial.