Caracterização funcional de sistemas de dois componentes em Xanthomonas citri - Oliveira, Duilio Rodrigues de (2019)
Xanthomonas citri subsp. citri, é uma bactéria pertencente à classe das Gamaproteobactérias, fitopatogênica, que exibe uma especificidade patógeno-hospedeiro extremamente alta. X. citri infecta plantas do gênero Citrus, causando o cancro cítrico, uma doença destrutiva encontrada em cultivos ao redor do mundo. Esta bactéria apresenta em seu genoma 34 genes que codificam proteínas relacionadas com o metabolismo do segundo mensageiro c-di-GMP. Em geral, níveis elevados de c-di-GMP favorecem a sessilidade e a produção de exopolissacarídeos, enquanto níveis mais baixos resultam em maior motilidade e aumento na dispersão do biofilme. Com o intuito inicial de buscar novos alvos de X. citri que dependessem dos níveis intracelulares desse segundo mensageiro, foram analisados os proteomas de linhagens mutantes em diguanilato ciclases específicas. Nas análises proteômicas por eletroforese bidimensional foram identificadas 15 proteínas diferencialmente expressas presentes em mais de um dos proteomas dos mutantes analisados. Entre estas, duas proteínas reguladoras de resposta e preditas de participar de sistemas de dois componentes, XAC0834 e XAC3443, foram encontradas sendo mais expressas em mutantes que apresentavam fenótipo de alto c-di-GMP; enquanto uma proteína hipotética provavelmente presente na membrana, XAC3657, estava mais expressa em linhagens com fenótipos relacionados a baixos níveis de c-di-GMP. Por meio de uma análise por qRT-PCR foi verificado que os níveis de mRNA para XAC0834 e XAC3443 não variam entre as linhagens e, portanto, a diferença nos níveis de expressão destas proteínas deve ocorrer póstranscricionalmente. Como os sistemas de dois componentes e proteínas de membrana são importantes para a adaptação das bactérias a diferentes condições ambientais, o objetivo do presente trabalho foi a caracterização funcional de XAC0834, XAC3433 e XAC3657, com maiorênfase em XAC0834 e na provável proteína sensora cognata, XAC0835, de forma a contribuir para a melhor compreensão dos processos de regulação da virulência de bactérias. Na análise da organização gênica dos genes que codificam estas proteínas, foi verificado que os genes XAC0834 e XAC0835 formam um operon, juntamente com a tioesterase XAC0833 e, portanto, o nível transcricional destes genes ocorre pelos mesmos reguladores, apoiando a hipótese de se tratarem de um sistema de dois componentes; assim como os genes XAC3442 e XAC3443. Utilizando uma linhagem mutante em XAC0834, mostramos que esta proteína impacta positivamente a motilidade sliding e a formação de biofilme, e tem efeito contrário no crescimento de X. citri em meio rico 2xTY e na motilidade twitching. Como estes fenótipos são modulados por c-di-GMP, é possível que a deleção deste gene altere significativamente os níveis de c-di-GMP nas células. Além disto, foi verificado que as proteínas XAC0835, XAC3443 e XAC3657 não afetam a motilidade sliding, mas, individualmente, XAC0835 é importante para a formação de biofilme; XAC3657 afeta negativamente o crescimento de X. citri em meio rico 2xTY; e XAC3443 afeta negativamente a motilidade twitching. Na análise do transcritoma da superexpressão de XAC0834, foi observado que havia aumento na expressão de genes relacionados ao sistema de secreção do tipo IV e na montagem do pilus do tipo IV, em comparação com a linhagem selvagem, o que pode estar relacionado aos fenótipos observados. Este trabalho forneceu subsídios importantes para a compreensão do papel fisiológico do sistema de dois componentes XAC0834/XAC0835, assim como do regulador de resposta XAC3443 e da proteína hipotética, XAC3657, em X. citri, o que pode contribuir para o entendimento da relação de c-di-GMP com os sistemas de dois componentes.