Eliminação antígeno-específica de células-alvo caspase-8 - suficientes ou - deficientes por linfócitos T CD8+ - Sampaio, Isabella Suzuki (2018)
A eliminação de células-alvo por linfócitos T citotóxicos (CTLs) exerce um papel importante na imunidade protetora contra patógenos e células tumorais, o que pode ser desencadeada pela ação de perforina e granzima, ou pelas interações Fas-FasL. A interação Fas-FasL promove a apoptose pela formação de DISC, que é composto pela cauda citoplasmática de Fas, a proteína adaptadora FADD e a pro-caspase-8. Nesse complexo, a caspase-8 é ativada e induz a clivagem das caspases efetoras -3, -6 e -7, e/ou BID - membro da família Bcl-2, desencadeando o sinal apoptótico. Devido à sua relevância na sinalização apoptótica, a caspase-8 é alvo de inúmeros estudos. Uma correlação entre mutações no gene CASP8 de células tumorais e alta atividade citolítica foi demonstrada, sugerindo que a deficiência em caspase-8 pode representar um mecanismo de evasão imune. Nesse projeto, nosso objetivo foi avaliar o efeito da deficiência em caspase-8 na eliminação de células-alvo por linfócitos T CD8&#43. Para isso, nós estabelecemos uma técnica de citotoxicidade in vitro utilizando blastos de camundongos OTI como células efetoras e células RMA como alvo. Nesse ensaio, as células-alvo foram marcadas e pulsadas com diferentes concentrações de peptídeo OVA e colocadas em co-cultura a diferentes razões efetora: alvo (E:A) com linfócitos OTI, estimulados por 7 dias com ConA e rIL-2. A eliminação específica foi avaliada após 16 horas de co-cultura. Como controle para avaliar a especificidade ao MHC de classe I, utilizamos as células RMA-S, uma vez que expressam níveis reduzidos desta molécula na superfície. Os resultados demonstraram que o ensaio estabelecido é eficiente e antígeno-específico. Foi também observado que a eliminação das células RMA-S é menor em comparação com as células RMA, sendo essa diferença melhor discriminada em condições com números limitados de células efetoras. Para avaliar o efeito da caspase-8, células RMA caspase-8-suficientes e -deficientes, obtidas pela técnica CRISPR-Cas9, foram utilizadas como alvo nesse ensaio. Os resultados demonstram que, em condições com menor número de células efetoras, as células caspase-8-deficientes são significativamente mais resistentes à eliminação por linfócitos T CD8&#43, em comparação com as células caspase-8-suficientes. Portanto, nossos dados corroboram com a ideia de que a deficiência em caspase-8 poderia representar um mecanismo de evasão imune, principalmente na eliminação por linfócitos T CD8&#43.