Desenvolvimento e produção de uma nova vacina pneumocócica de nanopartículas formulada para administração em pó por via pulmonar - Figueiredo, Douglas Borges de (2019)
Doenças pneumocócicas são a principal causa de óbitos entre crianças menores de 5 anos em todo o mundo. Dado o crescente número de cepas de Streptococcus pneumoniae resistentes a antibióticos, a vacinação é a forma mais eficiente de prevenir doenças causadas por esta bactéria. Embora existam várias vacinas pneumocócicas no mercado, todas são baseadas no polissacarídeo capsular do pneumococo. Estas vacinas têm cobertura limitada, já que é inviável incluir os polissacarídeos dos mais de 90 sorotipos diferentes de S. pneumoniae, e promovem a substituição de sorotipos na população por aqueles não cobertos pela vacina. Uma alternativa que contornaria este problema seria a produção de vacinas baseadas em antígenos conservados entre todos os sorotipos. Destes, proteínas de S. pneumoniae têm se mostrado candidatas promissoras. O objetivo deste trabalho é produzir e avaliar in vitro e in vivo uma vacina pneumocócica composta por proteínas de S. pneumoniae carregadas em nanopartículas poliméricas visando a imunização pela via pulmonar. As proteínas escolhidas foram a pneumolisina geneticamente detoxificada (PdT), e um fragmento da proteína A de superfície do pneumococo do clado 4 (PspA4Pro). O gene da PdT foi expresso em Escherichia coli e a proteína produzida foi reconhecidas por anticorpos produzidos contra a célula inteira de pneumococo via western blot. Estoques produtores de PdT foram preparados para experimentos futuros. A PspA4Pro foi purificada através da lise da biomassa em homogeneizador de alta pressão, precipitação de contaminantes com detergente catiônico, cromatografias de troca iônica e crioprecipitação em pH ácido. Ferramenta de planejamento experimental foi utilizada para otimizar a etapa de precipitação com detergente. A PspA4Pro foi inserida em nanopartículas de poli-(glicerol adipato-co--pentadecalactona) (PGA-co-PDL) ou de polímero X produzidas com ou sem diferentes tipos de quitosana. Estas nanopartículas foram encapsuladas em micropartículas de L-leucina pela técnica de spray dry. As nanopartículas produzidas apresentaram tamanho menor do que 200 nm, ideal para a internalização por células dendríticas, baixa polidispersão e baixa toxicidade. As proteínas liberadas das nanopartículas mantiveram sua integridade, a capacidade de ligar à lactoferrina humana e foram reconhecidas por anticorpos anti-PspA. O ensaio de aerolização das micropartículas mostraram que estas são capazes de chegar às vias aéreas inferiores de humanos e ensaios in vitro mostraram que as micropartículas foram capazes de ativar células dendríticas extraídas da medula óssea de camundongos. Camundongos imunizados por via pulmonar com duas doses das micropartículas produziram mais IgG anti-PspA do que animais imunizados via subcutânea ou via pulmonar com PspA4Pro e tiveram taxas de sobrevivência mais alta quando desafiados com S. pneumoniae. Tanto as nanopartículas de PGA-co-PDL quanto as de X se mostraram promissoras para serem utilizadas como veículos para vacinas pneumocócicas dado seu potencial adjuvante e por permitirem o transporte a seco das proteínas sem degradação e mantendo sua imunogenicidade.