Caracterização funcional de sistemas de secreção do tipo I e proteínas RTX de Chromobacterium violaceum - Freire, Raquel Sousa (2022)
As bactérias Gram-negativas têm múltiplos sistemas de secreção para transportar proteínas através do envelope celular. O sistema de secreção do tipo I (T1SS) é um translocador tripartite formado por transportador ABC, proteína de fusão de membrana (MFP) e proteína de membrana externa (OMP). Dentre os substratos secretados por T1SS, as proteínas RTX ligadoras de cálcio podem ser toxinas ou adesinas envolvidas na relação de bactérias com hospedeiros. Neste trabalho, estudamos os T1SSs e as proteínas RTX de Chromobacterium violaceum, uma β-proteobactéria Gram-negativa encontrada no solo e na água que pode causar doença grave em humanos. Por meio da análise in silico, identificamos quatro clusters de genes que codificam T1SSs em C. violaceum. Em três desses clusters, encontramos genes que codificam seus substratos putativos, três grandes proteínas RTX. Construímos linhagens mutantes nulas sem as proteínas ABC/MFP (mutantes ΔT1SS) ou sem as proteínas RTX (mutantes ΔRTX). Ensaios de curvas de crescimento, viabilidade celular, hemólise e virulência em camundongos demonstraram que todas as linhagens mutantes se comportam de maneira semelhante à linhagem WT, indicando que estes genes não influenciam no fitness, na atividade hemolítica e na virulência de C. violaceum. Ensaios temporais de formação do biofilme e de agregação celular revelaram que os mutantes ΔCV_0311 e ΔCV_0306/07 apresentam redução na formação de biofilme e de agregados celulares na fase inicial de cultivo, indicando que a proteína RTX CV_0311 e seu T1SS CV_0306/07/08 desempenham papel importante na adesão célula-célula e célula-superfície abiótica na iniciação do biofilme. Demostramos por análises de SDS-PAGE e espectrometria de massa que a proteína CV_0311 é uma adesina RTX gigante de C. violaceum secretada exclusivamente pelo T1SS CV0306/07/08 em alta densidade celular, uma vez que tal proteína não foi detectada em sobrenadantes dos mutantes ΔCV_0311 e ΔCV_0306/07 nem no sobrenadante da linhagem WT em baixa densidade celular. Além disso, nossos dados indicam que o cálcio é necessário para agregação celular, provavelmente por auxiliar na função da proteína CV_0311, uma vez que a restrição desse íon causou diminuição da agregação celular na linhagem WT. Em conjunto, nossos dados apoiam um modelo em que a adesina RTX gigante CV_0311 é secretada pelo T1SS CV_0306/07/08, mas fica ancorada na superfície da célula em baixa densidade celular mediando formação de biofilme por atuar em adesão célula-célula e célula-substrato abiótico, sendo liberada apenas em alta densidade celular para o meio externo.