Expressão, purificação e cristalização de Thi1, proteína envolvida na biossíntese de tiamina e no reparo de lesões de DNA - Godoi, Paulo Henrique Conaggin (1998)
Esta dissertação é parte de um projeto de pesquisa no qual pretende-se determinar a estrutura tridimensional da proteína Thi 1, recentemente identificada, e possivelmente relàcionada ao reparo de DNA em Arabidopsis thaliana assim como na biossíntese do anel de tiazol de tiamina (vitamina B1). O mecanismo catalítico desempenhado por essa proteína também deverá ser proposto se possível. O gene thil e sua forma deletada ΔN2, sem as bases que codificam para os primeiros 55 aminoácidos, previamente identificados como um peptídeo de translocação para o cloroplasto, foram subclonados em um plasmídeo pET-28 e inseridos imediatamente após uma sequência de 6 histidinas consecutivas. Este procedimento permitiu a expressão em larga escala de ambas as proteínas, entretanto, apenas a proteína deletada pode ser purificada em uma coluna de afinidade contendo íons de níquel imobilizados. A proteína recombinante foi cristalizada a 4ºC, inicialmente em duas condições diferentes, sendo a mais fovorável em tampão Bicina 100mM pH8,8 contendo (NH4)2SO4 800mM, apresentando um hábito de placas finas. Apesar disso, novos experimentos objetivando a melhora do hábito cristalino forneceram resultados favoráveis até o momento e continuam sendo desenvolvidas. A coleta de dados deverá ser feita no próprio laboratório e em fonte de luz síncrotron. Devido a falta de homologia com qualquer outra proteína com estrutura tridimensional conhecida, a estratégia a ser adotada para a resolução da estrutura será a de substituição isomorfa múltipla, requerendo ao menos dois derivados de átomos pesados da proteína.