Estudo da Interação entre Dinitrosilos Complexos de Ferro (DNIC) e Tiorredoxina 1 (S. cerevisiae) - Pinho, Arthur Migliatti Vetorazzi Ferreira de (2025)
O óxido nítrico (NO) é uma molécula radicalar produzida endogenamente, com diversas funções biológicas, incluindo vasodilatação, neurotransmissão e defesa contra organismos invasores. Em meio biológico, o metabólito mais abundante de NO são os dinitrosilos complexos de ferro (DNICs). Além dos dois fragmentos de NO, os DNICs também possuem outros dois ligantes, que em células, são majoritariamente moléculas tiólicas de alto peso molecular, como proteínas. Embora a identidade de tais proteínas ainda não tenha sido completamente esclarecida, estudos iniciais realizados em nosso laboratório sugerem que aquelas que se ligam por dois resíduos de aminoácido formam DNICs mais estáveis. Estudos na literatura indicam que o aumento da concentração de NO em células tumorais de epitélio mamário humano leva a uma queda no metabolismo de H2O2, ao passo que é sabido que, nestas condições, também é favorecida a formação de DNIC. Com isso em mente, a tiorredoxina 1 (Trx1) pode ser uma proteína relevante, pois seu sítio ativo é composto por dois resíduos de cisteína separados apenas por dois resíduos de aminoácido, e ela participa do metabolismo de peróxido de hidrogênio (H2O2). Assim, o objetivo deste trabalho foi investigar a capacidade da Trx1 de S. cerevisiae (yTrx1) de formar DNIC (DNIC-yTrx1) em meio aquoso, caracterizar o complexo formado, e avaliar o impacto dessa formação sobre a atividade redutase da yTrx1. Para isso, expressamos e purificamos a yTrx1 e sintetizamos o DNIC-GS por de dois métodos de síntese. Demonstramos por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) que um dos métodos leva a formação, em concentração mais de duas vezes maiores, de moléculas oxidantes (GSSG e GSNO) que impactam no rendimento de formação do DNIC-yTrx1. Em seguida analisamos a cinética de reação entre yTrx1 e DNIC-GS por Ressonância Paramagnética de Elétrons (EPR), obtivemos um sinal axial (g⊥ =2,038 e g|| = 2,022) e estimamos a ordem de grandeza da constante de velocidade de segunda ordem (k ~ 70M-1s-1). Também estimamos a constante de dissociação (Kd ~ (1,4 ± 0,9)×10-1M-1) do complexo DNIC-yTrx1. Em análise do DNIC-yTrx1 por espectroscopia eletrônica de absorbância, observamos a formação de dois picos nos comprimentos de onda 335nm (ε = 4308 ± 149M-1cm-1) e 400nm (ε = 3250 ± 140M-1cm-1), enquanto por espectroscopia fluorescência observamos que a formação do DNIC-yTrx1 leva a uma queda de 40% na emissão em 305nm com relação a yTrx1 livre. Realizamos a eletroforese em gel nativo da solução de DNIC-yTrx1, a partir da qual pudemos confirmar a formação de uma banda característica do complexo. Por EPR, obtivemos resultados iniciais que o DNIC-yTrx1 se mantém estável por 60 horas após a adição de BSA como proteína. Finalmente, comprovamos que a proteína perde sua atividade redutase após formação de DNIC-yTrx1. De acordo com os dados obtidos neste trabalho, a yTrx1 tem capacidade de ligarse a DNIC formando um complexo estável e que resulta na perda de sua atividade enzimática. Tais achados podem contribuir para elucidar as observações experimentais de queda no metabolismo de H2O2 em decorrência do aumento de NO via formação de DNIC.