Análise comparativa e caracterização bioquímica e funcional de duas serinoproteases isoladas da peçonha de Bothrops pirajai - Menaldo, Danilo Luccas (2012)
As peçonhas de serpentes possuem enzimas proteolíticas como metaloproteases e serinoproteases que afetam o sistema hemostático por diversos mecanismos. O presente trabalho teve como objetivo o isolamento e a caracterização bioquímica e funcional de duas serinoproteases da peçonha de Bothrops pirajai, bem como uma análise comparativa entre estas enzimas. O processo de isolamento foi realizado por três etapas cromatográficas consecutivas (exclusão molecular em Sephacryl S-200 seguida por afinidade em Benzamidine Sepharose e fase reversa em C2/C18), resultando em duas serinoproteases distintas, denominadas BpirSP27 e BpirSP41 de acordo com suas massas moleculares determinadas por espectrometria de massas (27 e 41 kDa, respectivamente). Conforme estimativas por SDS-PAGE, a BpirSP27 mostrou redução de sua massa molecular de 32 kDa para 27 kDa após deglicosilação com PNGase F em condições desnaturantes, enquanto que a BpirSP41 apresentou maior conteúdo de carboidratos N-ligados (~42%), tendo sua massa molecular reduzida de 49 kDa para 28 kDa após deglicosilação. Ambas são enzimas ácidas, sendo o pI da BpirSP27 de aproximadamente 4,7 e o da BpirSP41 de 3,7. As sequências parciais de aminoácidos das serinoproteases apresentaram identidade de 61% entre si, e o alinhamento múltiplo de ambas mostrou alta similaridade com as sequências de outras serinoproteases de peçonhas de serpentes. As enzimas mostraram ações distintas sobre o fibrinogênio bovino, com a BpirSP27 agindo preferencialmente sobre a cadeia Bβ e a BpirSP41 sobre as cadeias Aα e Bβ. As duas serinoproteases também foram capazes de degradar coágulos de fibrina e de sangue in vitro dependendo da dose e do tempo de incubação, com resultados superiores para a BpirSP41. Ambas as enzimas coagularam o plasma humano de forma dose-dependente, sendo que a BpirSP41 apresentou maior potencial coagulante, com dose coagulante mínima (DCM) de ~3,5 µg contra 20 µg para a BpirSP27. A perda da N-glicosilação por tratamento com PNGase F afetou a atividade coagulante das serinoproteases, sugerindo que os carboidratos N-ligados interferem na atividade catalítica destas enzimas. A atividade esterásica sobre o TAME foi avaliada em diferentes pHs e temperaturas, mostrando que as duas enzimas são bastante estáveis e perdem parte de suas atividades somente em pHs extremamente ácidos ou na temperatura extrema de 100°C. Além disso, as serino proteases foram capazes de hidrolisar substratos cromogênicos como o S-2238, específico para enzimas trombina-símile, e outros como S-2222, S-2266 e S-2302, sendo que somente a BpirSP27 agiu sobre o substrato S-2251 para plasmina. Na presença do íon Cu2+ e após tratamento com inibidores específicos de serinoproteases (PMSF, benzamidina, leupeptina e aprotinina), as atividades das duas enzimas foram significativamente reduzidas, sendo a BpirSP41 menos sensível ao PMSF do que a BpirSP27. O ensaio sobre plaquetas lavadas mostrou que a BpirSP27 induziu maior agregação plaquetária em relação à BpirSP41, tanto na presença quanto na ausência do íon cálcio. Os ensaios de inibição da atividade hemolítica promovida pelo sistema complemento mostraram uma maior ação da BpirSP41 sobre as vias clássica/das lectinas em relação à BpirSP27, e ambas apresentaram efeitos inibitórios similares sobre a via alternativa. As serinoproteases apresentaram efeitos discretos sobre processos inflamatórios como a indução de edema e dor, promovendo ainda um pronunciado recrutamento de neutrófilos sem induzir aumento significativo na quantidade total de leucócitos no exsudato inflamatório, o que sugere que estas enzimas devem apresentar um papel menor na inflamação causada pela peçonha de B. pirajai. Os resultados obtidos sugerem que as diferenças encontradas entre as atividades das enzimas BpirSP27 e BpirSP41 devem estar relacionadas principalmente às suas pronunciadas diferenças estruturais, incluindo diferentes sequências de aminoácidos e taxas de glicosilação.