Avaliação do ensaio RT-qPCR LN34 Pan-Lyssavirus para a detecção do vírus da raiva no Brasil - Chierato, Maria Eduarda Rodrigues (2021)
A raiva, causada pelo rabies virus (RABV), caracteriza-se por ser uma encefalomielite viral aguda. O RABV pertence ao gênero Lyssavirus, que contempla outros 17 vírus. Como a raiva é uma doença que apresenta letalidade próxima a 100%, as técnicas de diagnóstico devem se mostrar precisas e fidedignas, para que possa ser realizado o controle da doença. A prova padrão ouro para o diagnóstico é a imunofluorescência direta (IFD), uma vez que apresenta alta sensibilidade e especificidade. Porém, problemas como o estado avançado de autólise das amostras, baixa carga viral, qualidade inapropriada dos insumos e até mesmo a inexperiência de profissionais para a leitura das lâminas, podem diminuir a acurácia dos resultados. O ensaio LN34 Pan-Lyssavirus para RT-PCR em tempo real (RT-qPCR), que combina primers degenerados e múltiplos com sonda de hidrólise do tipo Locked Nucleic Acid (LNA), é um candidato para ser prova confirmatória da IFD, devido a sua facilidade de manuseio e capacidade de detectar as diferentes espécies de vírus dentro do gênero Lyssavirus, e por apresentar alta especificidade e sensibilidade. Esse ensaio detecta e amplifica porção leader 3’ do genoma e a região inicial do gene codificador da nucleoproteína, considerada a mais conservada entre os Lyssavirus. Esse estudo visa a padronização e implementação do ensaio LN34 Pan-Lyssavirusde RT-qPCR para detecção das diferentes linhagens genéticas e variantes antigênicas do RABV descritas no Brasil. Para isso, foram coletadas 324 amostras positivas e compatíveis com as diferentes variantes antigênicas e linhagens genéticas do RABV presentes no Brasil, e testadas na RT-qPCR utilizando o ensaio LN34 Pan-Lyssavirus. A RT-qPCR two-steps com ensaio LN34 Pan-Lyssavirus apresentou uma positividade de 87,3%, e 41 amostras obtiveram resultado falso negativo. Estas amostras, que tiveram resultado falso-negativo na RT-qPCR two-steps, foram testadas na técnica de RT- qPCR one-step com ensaio LN34 Pan-Lyssavirus, e todas tiveram o resultado verdadeiro positivo confirmado. Diante desses resultados, é possível inferir que a utilização do ensaio LN34 com a RT-qPCR em duas etapas apresenta dificuldade de detecção das diferentes linhagens genéticas e variantes antigênicas do RABV, possivelmente devido ao não anelamento do primer senso durante a transcrição reversa. Por outro lado, a RT-qPCR em uma etapa com o ensaio LN34 Pan-Lyssavirus foi capaz de detectar e amplificar aquelas amostras falso negativas pela reação em duas etapas, se mostrando um teste altamente sensível, e com potencial para ser utilizado como prova confirmatória à IFD para o diagnóstico da raiva no Brasil.