Região MHM de Gallus gallus domesticus: padrão de metilação do DNA, número de cópias e sexagem - Eiras, Matheus Credendio (2017)
As aves apresentam o sistema de cromossomos sexuais ZZ/ZW (macho e fêmea, respectivamente). Os mecanismos de determinação sexual para esses animais parecem envolver genes Z- e W-específicos. Há evidências de que mecanismos epigenéticos possam estar associados, incluindo neste caso a região hipermetilada no macho (male hypermethylated ou MHM), a qual é transcrita em um RNA não codificante que se acumula próximo ao sítio de transcrição, de forma similar ao que ocorre com o RNA Xist (X-inactive specific transcript). No entanto, não há dados suficientes que demonstrem a existência de um mecanismo de compensação de dose em aves. Os objetivos do presente projeto foram caracterizar, por meio de técnicas de biologia molecular, o padrão de metilação da região MHM em Gallus gallus domesticus e criar um teste de sexagem baseado no número de cópias da região MHM, presente no cromossomo Z. O DNA foi extraído de diferentes tecidos (pena, coração, cérebro, gônada, rim, pulmão, fígado, músculo e sangue) de oito animais adultos e vinte filhotes. O padrão de metilação da região MHM foi caracterizado por meio de sequenciamento de DNA pós-modificação com bissulfito de sódio. Identificamos os pontos de metilação da região estudada, que apresentou um padrão hipermetilado (92,3%) nas amostras provenientes de macho e um padrão hipometilado (2,1%) nas amostras de fêmea. O teste de sexagem por PCR tempo real quantitativa (qPCR) baseado no número de cópias da região MHM apresentou um acerto de 100% para todos os tecidos analisados, no entanto, os parâmetros utilizados para o DNA proveniente de fígado devem ser diferentes dos demais tecidos. Não encontramos diferença no número total de cópias da região MHM entre os animais do mesmo sexo, mas identificamos diferenças no número de cópias da região MHM entre os tecidos de um mesmo animal, sendo que o que apresenta o menor número de cópias da região MHM é o fígado, seguido por músculo, rim, coração, pulmão, gônada, cérebro e sangue. Além disso, verificamos uma nítida diferença entre o número de cópias da região MHM no DNA de fígado de filhotes e adultos, sugerindo que os pintinhos iniciam a sua vida com um número menor de cópias da região MHM no DNA do fígado e vão ganhando cópias ao longo da vida, até atingir os valores encontrados nos adultos. Os resultados abrem as portas para a elaboração de novas perguntas e formulação de novas hipóteses, além de esclarecer pontos importantes sobre essa complexa região, envolvida no processo de compensação de dose e determinação sexual das galinhas.