Ativação do inflamassoma e a produção de IL-1 em macrófagos de camundongos selecionados para diferente capacidade inflamatória - Monteleone, Leticia Figueiredo (2023)
Camundongos geneticamente selecionados para máxima (AIRmax) e mínima (AIRmin) resposta inflamatória aguda têm sido empregados em diversos estudos sobre fatores genéticos envolvidos no processo de inflamação. A partir de análises de associação e um sinal de linkage altamente significativo (LOD score = 72) entre SNPs e fenótipos de AIR avaliados durante a seleção e a produção de IL-1 &#223 , foi delimitada uma região em 128Mb (intervalo de 3.5Mb) no cromossomo 7, denominado locus Irm1. Após sequenciamento desta região, observou-se que PYCARD, responsável por codificar a proteína adaptadora ASC o qual é essencial no processamento de IL-1 &#223 e IL-18 após a ativação de inflamassomas, estava entre os genes que apresentaram polimorfismo. O objetivo deste estudo é é caracterizar a influência da mutação encontrada no gene PYCARD através da produção de IL-1 &#223 por macrófagos nestes animais. Para isso, após estímulos como LPS e ATP, medimos os níveis de IL-1 &#223 secretada por ELISA e, enquanto AIRmax produz altos níveis de IL-1 &#223 , em AIRmin foram dosados níveis baixos ou a citocina não foi detectada. Após genotipagem, observamos que, em AIRmax, os alelos do gene PYCARD estão fixados em homozigose, mas AIRmin ainda apresentava polimorfismo. Através de acasalamentos assistidos por genotipagem, produzimos sublinhagens de AIRmin que expressam genótipos diferentes de PYCARD (CC, CT, TT) e vimos que esta variação genotípica não interferiu na modulação da resposta inflamatória aguda ao Biogel, uma vez que a diferença fenotípica de AIR se manteve, ou na produção de citocinas inflamatórias como IL-6, IP-10 e IFN-ϒ. No entanto, ao dosarmos os níveis de IL-1 &#223 após ativação de diferentes inflamassomas, como NLRP3, NLRC4 e AIM2, vemos que a variação genotípica influencia na produção da citocina, uma vez que AIRmaxCC e AIRminCC liberaram altos níveis de IL-1 &#223 , enquanto em AIRminTT a citocina não foi detectada. Também houve um aumento na quantificação das proteínas pró- IL-1 &#223 e ASC em BMDMs de AIRmaxCC e AIRminCC estimulados para ativação do NLRP3. Observamos também uma queda significativa no número de células viáveis em AIRmaxCC após ativação por LPS + ATP, o que não ocorreu nas sublinhagens de AIRmin. Além disso, utilizando um substrato fluorométrico (YVAD-AFC), analisamos a atividade da Caspase-1 e vimos que esta é significativamente menor em animais AIRmin homozigotos para o alelo mutado. Por microscopia confocal e citometria de fluxo (HCS e AMNIS) conseguimos demonstrar a formação de ASC specks e a presença de GSDMD e caspase-1 ativa no citosol celular após ativação do NLRP3 em mácrofagos AIRmaxCC e em AIRminCC, este último com menor frequência. Já em AIRminTT não foi posível identificar a formação dos specks ou um aumento significativo na quantidade de GSDMD. Nossos resultados sugerem que a troca de aminoácidos, ocasionada pelo polimorfismo de ocorrência natural encontrado em AIRmin, interfere na formação do agregado de moléculas ASC, provocando uma perda de habilidade da proteína de ativar diferentes tipo de inflamassoma. Além disso, a mutação não parece influenciar a produção de outras citocinas inflamatórias, onde podemos observar ainda uma grande influência do background genético heterogêneo das linhagens AIR.