Medida da incorporação de precursores radioativos em glândulas salivares de Bradysia hygida. Aplicação a células individuais - Almeida, Jorge Cury de (1974)
O trabalho propõe um método para avaliar, por meio de cintilação em líquido, a incorporação de precursores radioativos na glândula salivar de dípteros; a espécie usada é o sciarídeo Bradysia hygida. O método é linear, sensível, reprodutível simples e resulta em soluções de satisfatória estabilidade. Sua eficiência é de cerca de 35% para trítio. São também propostos procedimentos para isolamento manual de células e de novelos cromossômicos individuais a partir de regiões de glândulas salivares fixadas. A sensibilidade do método proposto e os níveis de incorporação de timidina do material usado são tais que se torna possível a medida de incorporação daquele precursor em células e \"núcleos\" individuais. Do mesmo modo, o método deverá ser útil para medir a radioatividade de conjuntos de partes específicas de cromossomas. As primeiras informações obtidas são: 1- O tratamento com ácido acético a 50% por de 15 minutos, a temperatura ambiente, não remove quantidade detectável de DNA marcado. 2- Glândulas salivares submetidas à fixação citológica em etanol-formol-acético, em etanol-acético e em formalina são adequadas para radiometria pelo método descrito, o que torna factíveis estudo autorradiográfico e radiométrico paralelos de material tratado do mesmo modo. 3- Pelo menos 95% da timidina tritiada incorporada nas células da glândula salivar são devidos a síntese de DNA. Isso foi demonstrado por extração do material marcado em tricloroacético a 10% quente e por inibição da síntese de DNA pela hidroxiuréia. Também, cerca de 90% da radioatividade devida à incorporação de uridina-5-3H é removível por RNase. 4- A administração de hidroxiuréia mantém a síntese de DNA inibida a menos de 5% durante pelo menos 20 horas, nas idades larvais estudadas. Além disso, não promove perda de DNA marcado durante tempos curtos antes de sua administração. 5- A incorporação de timidina nas células da glândula salivar é quase exclusivamente nuclear. Mesmo 20 horas depois da marcação, não há diferença significativa entre os níveis de incorporação medidos em conjuntos de \"núcleos\" e em conjuntos de células removidas da mesma região glandular. De fato, esses níveis de incorporação são numericamente muito próximos. 6- É possível conseguir linearidade de aumento de radioatividade em função do tempo, até cerca de 90 minutos após a injeção do precursor na larva, desde que a atividade específica deste seja adequada. 7- Há diferenças muito grandes entre os níveis de incorporação, por célula, segundo a região glandular: as células da região anterior da glândula, nas idades estudadas, incorporam cerca de duas vêzes a quantidade de timidina que as células das regiões granulosa e mucosa. Por outro lado, as células da região mucosa incorporam cerca de duas vêzes a quantidade de uridina que as células das outras regiões. 8- são relatados dois experimentos destinados a estudar a estabilidade do DNA marcado durante dois tempos curtos do quarto estádio larval. Não houve evidência de perda de DNA marcado ou de transferência deste para o citoplasma. Contudo, a variabilidade de incorporação de larva para larva e de célula para célula, assim como uma contradição, devida provavelmente, a defeitos técnicos de execução, não permitem considerar esses resultados como evidência contra a possibilidade de que tais eventos ocorram na glândula salivar.