Expressão em sistema procarioto, purificação, caracterização e ensaios de atividade biológica in vitro do fator de crescimento de queratinócitos humano recombinante (rhKGF-1)

• Ano de defesa: 2024
• Autor(a) principal: Souza, Giovanna Fondato de
• Tipo de documento: Dissertação
• Tipo de acesso: Acesso aberto
• Idioma: por
• Instituição de defesa: Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP
• Palavras-chave em Português: Caracterização de proteína; Migração; Migration; Protein characterization; Proteína recombinante; Recombinant protein; rhKGF-1
• Link de acesso: https://www.teses.usp.br/teses/disponiveis/60/60141/tde-19082025-174741/

O fator de crescimento de fibroblastos (FGF-7), também conhecido como fator de crescimento de queratinócitos (KGF-1), é produzido por fibroblastos e atua em células epiteliais promovendo sua proliferação, migração e diferenciação por meio da interação com seu receptor (KGFR). Seu fármaco recombinante, conhecido como Palifermin (KepivanceTM), é usado na prevenção e tratamento da mucosite oral, reação inflamatória ulcerativa que acomete o trato gastrointestinal (TGI) de pacientes em tratamento quimio ou radioterápico, devido a sua atividade de prevenção e redução da incidência e duração das ulcerações. O rhKGF-1 também tem atividade citoprotetora, antiapoptótica, previne danos ao DNA, reduz a produção de citocinas pró-inflamatórias e promove a expressão de enzimas que protegem de radicais livres contribuindo para a redução da gravidade das lesões e da duração do quadro clínico de mucosite. Visando a melhoria da qualidade de vida de pacientes oncológicos que sofrem de mucosite oral, a proposta é produzir o rhKGF-1 recombinante nacionalmente com forma farmacêutica, diferente da comercializada no exterior, de administração local através de um sistema nanoparticulado como alternativa de tratamento inovadora para esses pacientes. Nesse trabalho foram testadas duas linhagens de bactérias de expressão [BL21(DE3) e Arctic Express(DE3)] que foram transformadas com o vetor recombinante pET28a(+) carreando um fragmento do gene hKGF-1. Os melhores resultados de expressão foram obtidos com a linhagem Arctic(DE3) com indução da expressão a 0,3 mM de IPTG por 16h a 18ºC. A expressão de proteínas foi avaliada por SDS-PAGE e confirmada por Western blotting. A proteína foi obtida de forma solúvel e purificada por cromatografia de afinidade com dois protocolos padronizados, com e sem mudança do pH de lavagem. A identificação da proteína de interesse foi confirmada por imunodetecção com anticorpo anti-His Tag e por espectrometria de massas. Foram realizados testes de citotoxicidade, proliferação e migração de células HaCaT incubadas com diferentes concentrações de rhKGF-1 em diferentes tempos, na ausência ou presença de heparina. Nesse trabalho foi possível a expressão de rhKGF-1 em bactérias Arctic(DE3) de modo solúvel possibilitando que a fase downstream do bioprocesso seja simplificado. Os resultados de atividade biológica demonstraram que a proteína recombinante não tem atividade citotóxica em células HaCaT. Os resultados de proliferação e migração se mostraram promissores para que essa proteína recombinante atue como um biofármaco, embora avaliações adicionais são necessárias.