Estudos sobre a proteína NS5 de Flavivirus brasileiros - Baleotti, Flávia Graciela (2002)
No gênero Flavivirus, da família Flaviviridae inclui-se um importante grupo de vírus transmitidos por artrópodes que é responsável por considerável morbidade e mortalidade, como nos casos do dengue e da febre amarela. Onze Flavivirus circulam no Brasil. Os Flavivirus são envelopados, possuem nucleocapsídeo contendo genoma RNA de fita simples e polaridade positiva com aproximadamente 11000 nucleotídeos. O genoma inclui uma pequena região 5\' não-codificadora, uma cadeia aberta de leitura (ORF) e um terminal 3\' não-codificador. A ORF codifica 3 proteínas estruturais C, preM, E e 7 proteínas não-estruturais NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e NS5. A proteína não-estrutural 5 (NS5) é a maior (2700 nucleotídeos) e mais conservada proteína dos Flavivirus e acredita-se que possua função de RNA-polimerase RNA-dependente. Foi tema de nosso estudo a sequência nucleotídica do gene NS5 de 15 estirpes de Flavivirus brasileiros, Bussuquara, Cacipacoré, dengue tipos 1 (2 estirpes), 2 (3 estirpes) e 4, Iguape, Ilhéus, Rocio, encefalite de Saint Louis (2 estirpes) e febre amarela (estirpe selvagem e vacinai). Primeiramente, desenvolvemos metodologia de RT-PCR com primers (FG1/FU1RC) amplificadores de 723 nucleotídeos no centro do gene NS5, que se mostrou específica para vírus do gênero porque detectou genoma dos 15 vírus estudados. Também, desenvolvemos nested-PCR com primers (NES A/NES B) internos aos amplicons da RT-PCR, que se mostrou sensível e adequada à confirmação da origem viral dos produtos amplificados. Esta RT-nesfed-PCR possui utilidade como método diagnóstico rápido de infecções por Flavivirus. Em seguida, utilizando sequência de 600 nucleotídeos oriunda dos amplicons da RT-PCR e de seus aminoácidos inferidos, efetuamos estudo filogenético. Árvores filogenéticas criadas pelos métodos neighbor-joining e parcimônia mostraram os Flavivirus brasileiros agrupados em três ramos: ramo do vírus da febre amarela, ramo dos vírus do dengue com sub-ramos para os tipos 1, 2 e 4, e o ramo denominado Encefalite japonesa, que inclui os vírus da encefalite de Saint Louis, Cacipacoré, Iguape, Rocio, Ilhéus e Bussuquara. Os vírus transmitidos por mosquitos Aedes, como dengue e febre amarela, e que também são os únicos Flavivirus causadores de febres hemorrágicas no Brasil mostraram-se agrupados no mesmo ramo. Os vírus transmitidos por mosquitos Culex e que são causadores de encefalite como Rocio, Ilhéus, SLE, Cacipacoré, Bussuquara e Iguape foram agrupados no da Encefalite japonesa. Finalmente, fizemos análise funcional da NS5 de 5 dos Flavivirus estudados observando que a região dos aminoácidos 250 a 900, apresentava alta homologia com RNA-polimerase RNA-dependente de diversos Flaviviridae. Nas sequências nucleotídicas foi possível identificar os motifs A (DTKAWD), B (SGQPDTSAGN), C (GDD) e D (EAGK). O encontro destes motifs característicos sugere fortemente que a NS5 dos Flavivirus possua função RNA-polimerase RNA-dependente.