Desenvolvimento de RT-PCR em tempo real para diagnóstico diferencial de chikungunya, dengue e Zika - Silva, Veronica Lippi Oliveira da (2019)
As doenças causadas pelos vírus da chikungunya (CHIKV), dengue (DENV) e Zika (ZIKV), principalmente na fase aguda, induzem sintomatologias muito semelhantes entre si. O CHIKV pertence ao gênero Alphavirus da família Togaviridae, enquanto os DENV e ZIKV pertencem ao gênero Flavivirus da família Flaviviridae. A rápida implementação de tratamento, especialmente nos pacientes com dengue, diminui drasticamente o número de casos fatais. O objetivo deste trabalho foi desenvolver métodos de transcrição reversa seguida da reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) em tempo real para diagnóstico diferencial e precoce de chikungunya, dengue e Zika. Sondas e primers específicos para CHIKV, ZIKV e os quatro sorotipos de DENV (DENV-1 a -4) foram desenhados a partir dos primeiros nucleotídeos da extremidade 5\' dos genomas virais para amplificação de fragmentos com 150, 185 e 170 pares de bases para DENV, ZIKV e CHIKV, respectivamente. Diversos protocolos foram realizados para otimização da reação de RT-PCR em tempo real considerando as concentrações de sondas, íon magnésio e temperatura de anelamento de sondas e primers. Análises de reação cruzada mostraram que os primers e as sondas selecionadas foram altamente específicos para os vírus em questão, sem reconhecimento cruzado de outros flavivírus e alfavírus, com exceção das sondas para os DENV-3 e DENV-4 que apresentaram reação cruzada com outros sorotipos. A sonda para DENV-3 reconheceu cruzadamente o DENV-1 e a sonda para DENV-4 o DENV-2. O limite de detecção da RT-PCR para dengue com sondas foi de 9,90x104, 2,42x102, 6,55x106 e 3,70x106 cópias/mL para os DENV-1 a -4, respectivamente. Contudo, o limite de detecção da RT-PCR para dengue com SYBR Green foi de 9,90x101, 2,42x101, 6,55x103 e 3,70x101 cópias/mL para os DENV-1 a -4, respectivamente, inferior àquela utilizando sondas. Os limites de detecção da RT-PCR com sondas para o ZIKV e o CHIKV foram de 1,25x100 e 5,25x100 PFU/mL, respectivamente, similares aos resultados encontrados quando realizada a RT-PCR com SYBR Green para estes mesmos vírus que foram de 1,25x101 e 5,25x100 PFU/mL, respectivamente. Amostras de soro de indivíduos assintomáticos e amostras de soro, urina ou saliva armazenadas no biorrepositório \"Banco de amostras de arbovírus\" (FCFRP Nº 006) do Laboratório de Virologia da FCFRP-USP, foram testadas com a RT-PCR com SYBR Green para dengue, observando-se uma sensibilidade de 54%, especificidade de 100%, valores preditivos positivo e negativo de 100% e 75%, respectivamente. Entretanto, quando avaliadas apenas as amostras de soro, observou-se uma sensibilidade de 82%, especificidade de 100%, valores preditivos positivo e negativo de 100% e 71% respectivamente, sugerindo que as amostras de soro são as mais indicadas para utilização no diagnóstico da dengue. Estas amostras também foram analisadas com as RT-PCRs com sondas para os vírus chikungunya e Zika, sendo todas negativas. As amostras detectadas com a RT-PCR com SYBR Green para dengue foram analisadas com a RT-PCR com sondas, sendo observada uma concordância de mais de 90% com os sorotipos previamente identificados. Conclui-se, portanto, que a detecção diferencial dos vírus é eficaz e fiel em uma única etapa e o método possui alta especificidade e sensibilidade