Engenharia de uma endopoligalacturonase por inserção de diferentes CBMs (Carbohydrate Binding Modules): quimerogênese e efeito de proximidade - Carli, Sibeli De (2020)
O grande excedente de biomassa proveniente da agroindústria pode ser aproveitado para a produção de bioprodutos com alto valor agregado. Entre as estratégias para melhorar o aproveitamento e reduzir os custos relacionados com a hidrólise enzimática destes resíduos lignocelulósicos incluem-se a identificação e expressão heteróloga de enzimas com propriedades catalíticas interessantes, a utilização de técnicas de engenharia de proteínas, para melhorar as características das enzimas já identificadas e por fim, a formulação de coquetéis enzimáticos mais eficientes. A desconstrução precisa desta matriz lignocelulósica é bastante desafiadora e constitui uma barreira importante para alcançar uma produção razoável de bioprodutos a preços atraentes. Neste sentido, é conhecido que a presença de pectinas, um dos principais componentes da lamela média nas plantas, dificulta a hidrólise da parede celular vegetal e impede a liberação eficiente de açúcares, sendo então, necessário o desenvolvimento de tecnologias visando otimizar a hidrólise deste polissacarídeo. O presente trabalho visou avaliar as propriedades bioquímicas e cinéticas de uma endopoligalacturonase de Chondrostereum purpureum (EndoPGCp) expressa em Pichia pastoris e em Escherichia coli, bem como avaliar o efeito da imobilização sobre a atividade da enzima. Além disso, foi proposto o uso da quimerogênese para avaliar o efeito da proximidade de diferentes polissacarídeos presentes na parede celular vegetal sobre a atividade de uma EndoPGCp_bac, engenheirada pela adição de um módulo de ligação a carboidrato (CBM), bem como o potencial de aplicação na suplementação de um coquetel enzimático comercial para hidrólise de diferentes resíduos lignocelulósicos. A enzima expressa em P. pastoris apresentou uma massa molecular de cerca de 60,0 kDa, com um teor estimado de carboidratos de 67,0% (m/m). A temperatura ótima e o pH da catálise foram 60 - 70 °C e pH de 4,5, respectivamente. A enzima foi altamente estável em pH 6,0 - 8,0 e reteve cerca de 60% de sua atividade inicial após incubação a 70 °C por 30 min. A enzima hidrolisou pectina cítrica com Vmax e KM de 4947,10 ± 393,63 U.mg-1 e 2,45 ± 0,23 mg.mL-1, respectivamente, e apresentou eficiência catalítica de 2052,90 ± 193,54 mL.mg-1 s-1. Além disso, a enzima foi eficiente na clarificação de sucos de maçã e maracujá. Após a imobilização em nanopartículas ferromagnéticas, a enzima não apresentou alterações significativas em suas características bioquímicas e cinéticas e manteve cerca de 65% da atividade inicial após 7 ciclos de reuso. Na suplementação do coquetel comercial Celluclast, a EndoPGCp_Pp aumentou em 1,8 vezes a liberação de açúcares redutores de resíduos de laranja. Além disso, as enzimas expressas em E. coli foram reenoveladas a partir dos corpos de inclusão e processo de quimerogênese com os CBMs não afetou as propriedades da enzima. As enzimas hidrolisaram a pectina cítrica com Vmax e KM muito semelhantes. No entanto, significante aumento foi observado no kcat, uma vez que as quimeras 3N, 44N e 77N apresentaram valores 1,4, 1,6 e 1,3, vezes maiores, respectivamente, que o obtido para o domínio catalítico isolado. Como resultado, a eficiência catalítica (kcat/KM) para a hidrólise da pectina de citros foi cerca de 60, 75 e 30% maior para as quimeras 3N, 44N e 77N, respectivamente, em comparação ao obtido para a EndoPGCp_bac. Quando aplicadas na suplementação de um coquetel comercial para hidrólise de resíduos lignocelulósicos, os resultados indicaram que as pectinases podem melhor a eficiência da sacarificação da biomassa pela remoção da pectina que impedem a ação de outras enzimas. Além disso, a maior eficiência na hidrólise das enzimas quiméricas pode estar relacionada à ação dos CBMs, que podem aumentar muito a concentração da enzima nas proximidades do substrato, levando ao aumento na hidrólise da pectina e, consequentemente, diminuem a recalcitrância da parede celular vegetal à hidrólise enzimática.