Controle Redox em Neospora caninum: investigação de enzimas do sistema antioxidante - Brochi, Jade Cabestre Venancio (2022)
Neospora caninum é um parasita Apicomplexa e agente etiológico da neosporose, uma doença que resulta em sintomas neurológicos em cachorros e abortos em gado bovino. A neosporose está disseminada em todo o mundo e não possui tratamento eficaz aprovado. A sobrevivência e replicação de N. caninum dependem de sua capacidade de defesa do estresse oxidativo dentro da célula hospedeira. Nesse sentido, a elucidação de novas moléculas e mecanismos relacionados ao controle redox de N. caninum pode contribuir com o desenvolvimento de tratamentos para a neosporose. Portanto, neste trabalho descrevemos duas enzimas do Sistema redox: Peroxirredoxina (NcPrx, Capítulo 1) e Glutationa redutase (NcGR, Capítulo 2), bem como investigamos os efeitos das formas recombinantes de NcGR (rNcGR) e NcPrx (rNcPrx), e do H2O2 na invasão e proliferação do taquizoíta na célula Vero (Capítulo 3). As sequências de aminoácidos de NcPrx e NcGR apresentaram alta identidade e similaridade comparadas com os representantes homólogos do filo Apicomplexa. rNcPrx e rNcGR foram clonadas e expressas em Escherichia coli (BL21) com massa molecular predita (22 kDa e 52kDa, respectivamente) e a identidade das formas monoméricas e diméricas foram confirmadas por espectrometria de massas. A análise de imunofluorescência revelou que NcPrx e NcGR estão localizadas no citosol do taquizoíta. NcPrx e NcGR nativas e recombinantes foram detectadas por ELISA e western blot, utilizando os soros policlonais anti-rNcPrx e anti-rNcGR. rNcPrx apresentou atividade peroxidase e antioxidante in vitro. Além disso, H2O2 aumentou a dimerização de NcPrx em taquizoítas intracelulares e extracelulares. A atividade in vitro de rNcGR (875 nM) foi verificada avaliando a absorbância do NADPH (340nm). rNcGR apresentou perfil enzimático Michaeliano (Km(GSSG):0.10 ± 0.02 mM; kcat(GSSG): 0.076 ± 0.003 s-1; Km(NADPH): 0.006 ± 0.001 mM; kcat(NADPH): 0.080 ± 0.003 s-1). Além disso, rNcGR foi inibida pelos corantes fenotiazínicos (IC50 (azul de metileno): 2.1 ± 0.2 µM, IC50(1,9-dimetil-azul-de-metileno): 11 ± 2 µM, IC50(novo azul de metileno): 0.7 ± 0.1 µM, e IC50(azul de toluidina): 0.9 ± 0.2 µM). No capítulo 3, foi demonstrado que rNcPrx interfere na invasão de N. caninum de forma dependente do estado redox. rNcPrx oxidada inibiu a invasão e proliferação de N. caninum em células Vero. Por outro lado, a menor concentração de H2O2 (10 µM) estimulou a invasão de N. caninum, o que foi revertido em altas doses (> 100 µM). H2O2 inibiu a proliferação do parasita em uma menor concentração (IC50: 320 µM) quando comparado com a citotoxicidade em células Vero (CC50: 586 µM), resultando em um índice de seletividade positivo (1.8). Finalmente, nossos resultados demonstraram a importância de NcPrx e NcGR na biologia de N. caninum e em mecanismos antioxidantes. Nossos dados sugerem que NcGR é um importante alvo dos corantes fenotiazínicos na inibição da proliferação de N. caninum e que NcPrx atua no clearance de H2O2 e como um sensor deste peróxido no parasita. Além disso, mostramos que o desenvolvimento intracelular de N.caninum é influenciado por alterações redox em seu meio, contribuindo com a elucidação de mecanismos relacionados a propagação e controle deste parasita.