Expressão e caracterização da trealase neutra recombinante de Neurospora crassa - Almeida, Fabiana Maria de (2003)
A porção codificadora do gene da trealase neutra de Neurospora crassa (Genbank AF 044218) foi clonada no vetor de expressão pET21b em uma fusão carboxiterminal com uma seqüência que codifica para seis resíduos de histidina (cauda de histidina ou His tag). A construção resultante pET21b-NcTreB foi utilizada para transformação de Escherichia coli BL21(DE3) para obtenção da proteína recombinante pela indução das culturas com IPTG (isopropil β-D-galactopiranosídeo) 1mM a 25ºC. Após 3 horas, observamos significativo acúmulo de um polipeptídeo de ~84kDa, tamanho esperado para a trealase neutra de N. crassa. As bactérias de culturas induzidas com IPTG foram lisadas e os extratos separados em fração solúvel e insolúvel por centrifugação. A proteína recombinante distribui-se em ambas as frações, sendo que a fração solúvel foi utilizada na determinação da atividade. A trealase recombinante exibiu comportamento distinto da trealase endógena de E. coli, sendo estimulada por cálcio 10mM e inibida por EDTA. A proteína recombinante foi também utilizada na imunização de coelhos para obtenção de anticorpos policlonais. Os anticorpos produzidos foram utilizados para análise dos níveis de trealase em extratos de micélio em crescimento de N crassa através de immunoblotting. Observamos que ocorre um acúmulo da proteína na fase exponencial e um decréscimo na fase estacionária, sugerindo que a mobilização da trealose, verificada no início da germinação, se deve a ativação de uma enzima pré-existente. A trealase recombinante purificada através de cromatografia de afinidade em Ni-NTA agarose exibiu atividade específica de 80-140mU/mg de proteína, sendo que a máxima atividade foi obtida em pH 7,0 a 30ºC. A massa molecular da enzima recombinante, determinada por filtração em gel, foi estimada em ~81 kDa. A enzima recombinante é específica para a degradação de trealose. A sua meia-vida, a 40ºC, foi de 2 min e 30 s, sendo que a adição de cálcio ao ensaio protegeu parcialmente a enzima da inativação térmica. A enzima recombinante foi ativada por cálcio e manganês e inibida por ATP, cobre, prata, zinco, alumínio e cobalto. A KM, determinado para a trealose, foi de 42mM e a Vmax foi de 30,6nmol de glicose liberada por minuto. O efeito da fosforilação sobre a atividade da trealase recombinante foi testado por incubação com proteína quinase dependente de AMP cíclico (PKAc). Nas condições de ensaio utilizadas, apenas 0,13% das moléculas foram fosforiladas, resultando em uma ativação de 30%. Os resultados desse trabalho demonstram que a trealase neutra de N. crassa, expressa em E. coli, exibe parâmetros cinéticos e bioquímicos semelhantes às outras trealases neutras descritas em fungos. A análise da expressão da trealase em N. crassa sugere que, provavelmente, a enzima seja regulada por modificação pós-traducional, onde a via do AMP cíclico parece estar envolvida. Nossos resultados, aliados com os dados descritos na literatura, sugerem que a ativação in vivo da trealase neutra de N. crassa é um fenômeno complexo, onde uma provável interação entre a trealase e outros componentes protéicos, bem como a fosforilação por outras quinases, possam ser necessárias para a sua completa ativação.