Desenho e avaliação de um sistema enzimático recombinante para proteção in vitro de células epidérmicas humanas HaCaT ao estresse oxidativo - Adriani, Patricia Pereira (2021)
Durante a vida, a pele, principal barreira de defesa do corpo, neutraliza espécies reativas de oxigênio (ERO) produzidas por processos intrínsecos e extrínsecos; porém, com a idade, a geração de ERO aumenta e o mecanismo de defesa antioxidante diminui. Dessa forma, esse desbalanço leva ao progressivo dano de estruturas celulares. O presente trabalho teve por objetivo desenhar e avaliar o efeito de um sistema molecular de transdução constituído pelas proteínas recombinantes superóxido dismutase (TrSOD) e glutationa peroxidase (TrGPx) do fungo Trichoderma reesei em células epidérmicas de queratinócitos humanos HaCaT. A utilização desse sistema, constítuido por proteínas antioxidantes, tem a finalidade de reforçar o mecanismo de defesa celular contra ERO e, também, determinar sua potencial utilização como agente de proteção celular contra o estresse oxidativo. A enzima TrGPx fusionada ao peptídeo de penetração celular (PPC) PEP-1 (PEP1-TrGPx), foi expressa em E coli BL21(DE3), caracterizada funcionalmente através de ensaios de atividade enzimática, utilizando os substratos: tioredoxina, pirogalol e peróxido de hidrogênio, e estruturalmente através de cristalografia de raio X. Além disso, teve sua capacidade de proteção antioxidante em células HaCaT avaliada por meio do método que emprega o reagente H2DCF-DA (2\',7\'-diclorodihidrofluoresceína diacetato), demonstrando que PEP1-TrGPx forneceu proteção antioxidante nas células HaCaT submetidas ao estresse oxidativo. As enzimas TrSOD e TrSOD fusionada aos PPC TAT e a cauda de fluorescência amarela (YFP), denominada neste trabalho como TAT-TrSODy, foram expressas em E. coli BL21e tiveram suas atividades avaliadas através do método de NBT (azul de nitrotetrazólio) em gel não-desnaturante e foi demonstrado que as proteínas foram obtidas na sua forma ativa. Também foram realizados ensaios de citotoxidade utilizando-se o método de MTT para todas as proteínas estudadas; porém, nenhuma apresentou efeitos significativos na viabilidade das células HaCaT. Os dados obtidos mostram que o sistema enzimático desenhado é promissor na proteção contra o estresse oxidativo induzido em queratinócitos humanos HaCaT. As enzimas antioxidantes do estudo apresentam potencial de uso, principalmente para a indústria de cosméticos que buscam constantemente por novas tecnologias e ativos mais eficazes. Com isso, os resultados obtidos nessa tese demonstraram-se uma abordagem promissora para o desenvolvimento de novas terapias e produtos biotecnológicos.