Metilação do gene simportador sódio-iodo (NIS) em tumores de tireóide - Galrão, Ana Luiza Resende (2011)
O iodo é transportado para a célula tireoideana através do simportador sódio-iodo (NIS). Estudo anterior de nosso grupo mostrou que a expressão do RNAm de NIS estava reduzida nos tecidos tumorais (T) tireoideanos quando comparada à dos tecidos não tumorais (NT) adjacentes. A metilação de ilhas CpG localizadas em promotores é um dos mecanismos epigenéticos que regula a expressão gênica. Já foi demonstrado que a metilação aberrante desempenha papel importante na tumorigênese humana, porém, estudos qualitativos não conseguiram definir um padrão de metilação do promotor de NIS no câncer diferenciado de tireóide. Assim, o presente estudo visou (1) investigar o padrão de metilação do promotor do gene NIS em amostras T (benignos e malignos) e NT adjacentes, e correlacionar o grau de metilação com os valores de RNAm, e (2) identificar novas sequencias regulatórias, alvos de metilação do DNA, que pudessem também modular a expressão de NIS. Foram estudados 30 pares de amostras de tecido tireoideano T e NT adjacente, sendo 10 benignos e 20 malignos. Também foi avaliado um par de amostras de paciente com nódulo maligno com alta captação de iodo (hipercaptante). A metilação da ilha1 CpG foi avaliada por PCR Metilação Específica (MSP) semiquantitativa e a metilação da ilha2 CpG foi analisada por bissulfito seqüenciamento; ambas com DNA bissulfito convertido. Novas ferramentas de bioinformática foram utilizadas na análise in silico para identificar ilhas CpG funcionais na região 5\' upstream da seqüência promotora de NIS. Plasmídios foram construídos contendo o fragmento de DNA da Ilha2 CpG na frente de gene reporter (luciferase) e usados em transfecções de células HEK293 para avaliar a atividade regulatória desta ilha. Celulas tumorais com baixa expressão de NIS foram tratadas com agente desmetilante 5Aza e a expressão de RNAm de NIS foi avaliada por PCR em tempo real. Na ilha1 CpG, todas as amostras (T e NT) do grupo benigno e maligno apresentaram metilação, não observando-se diferença no grau de metilação entre os grupos. No entanto, maiores níveis de metilação foram detectados na região 5 desta ilha, que decresceram na direção da extremidade 3. Observou-se maior grau de metilação no tecido T em relação ao tecido NT adjacente (T>NT) em 60% das amostras do grupo benigno e em 35% do grupo maligno. Não foi identificada correlação entre o grau de metilação da ilha1 CpG e a expressão de RNAm de NIS. Nas amostras (T e NT) do paciente com tumor hipercaptante não foi detectada metilação nesta ilha. Assim foi realizada nova análise in silico, a qual identificou por primeira vez uma segunda ilha CpG, ilha2 CpG, com 256pb, localizada entre as posições -2152 e -1887 (em relação ao sítio ATG), contendo 14 sítios CpG. As analises da metilação da ilha2 CpG indicaram que essa região também é alvo de metilação, sendo observada hipermetilação (66.07%) em todas as amostras T quando comparada às amostras NT(23,21%), nos grupos benigno e maligno. A análise individual de cada par de amostras detectou um padrão de metilação do gene NIS em tecidos tireoideanos; sendo que 100% das amostras do grupo benigno e 95% das do grupo maligno apresentavam a ilha2 CpG mais metilada no tecido T do que no tecido NT (T>NT). Além disso, foi possível identificar correlação inversa significativa entre o grau de metilação da ilha2 CpG e a expressão gênica de NIS. Estudos in vitro para caracterização funcional da ilha CpG2 mostraram que esta nova ilha pode ser considerada como um enhancer do gene NIS na presença de fatores de transcrição da tireóide. Também foi possível detectar, em linhagem de carcinoma folicular da tireoide, a reexpressão do RNAm de NIS paralelamente à redução do grau de metilação da ilha2 CpG, após o tratamento com agente desmetilante. Sendo assim, confirmamos que a metilação do promotor NIS é um evento freqüente em amostras T (benignas e malignas) e NT. Este é o o primeiro trabalho que descreve a existência da ilha2 CpG, na região 5 do gene NIS, com atividade de enhancer, que regularia a expressão gênica por metilação do DNA. Pela primeira vez identificou-se a existência de um padrão de metilação no gene NIS em tecido tireoideanos (T>NT), assim como correlação inversa entre o grau de metilação da ilha2 CpG e a expressão de RNAm de NIS. Estes resultados poderiam explicar a reduzida expressão do NIS observada em amostras tumorais benignas e malignas e a baixa captação de iodo dos tumores tireoideanos