Inibidor de tripsina em Eucalyptus urophylla e seu efeito sobre o crescimento micelial in vitro de Pisolithus tinctorius e Rhizoctonia solani - Tremacoldi, Célia Regina (2001)
Plantas, animais e microrganismos apresentam inibidores de proteases, os quais são proteínas que podem complexar-se com proteases de microrganismos e insetos herbívoros, inibindo sua capacidade proteolítica. Estes inibidores pertencem ao grupo de proteínas e enzimas que participam dos mecanismos de defesa das plantas, mas não há relatos quanto ao seu papel em interações simbióticas. Desta maneira, este trabalho teve por objetivos verificar a presença de inibidores de proteases em E. urophylla e sua influência sobre o crescimento micelial in vitro do fungo ectomicorrízico P. tinctorius isolado 1604 (compatível com E. urophylla) e isolado 185 (incompatível), e também do patógeno R. solani, causador de tombamento de mudas em viveiros de plantas. Para se atingir os objetivos propostos, os extratos protéicos brutos de sementes, raízes e folhas de E. urophylla foram incubados com BAPNA (α-benzoil- arginina-p-nitroanilida) e BTPNA (α-benzoil-tirosina-p-nitroanilida), substratos sintéticos cromogênicos para tripsina/papaína e para quimotripsina (Sigma) respectivamente, em presença de tampão Tris-HCl 0,1 M (pH 8,0) para tripsina e quimotripsina e tampão acetato de sódio 0,2 M (pH 5,5) para papaína. Os resultados mostraram atividades de inibidores de tripsina e de papaína em sementes. A atividade de inibidor de tripsina também foi observada em raízes e folhas. A massa molecular do inibidor de tripsina de sementes, raízes e folhas foi estimada em cerca de 76 KDa, através de cromatografia líquida de exclusão molecular. O extrato bruto de sementes e frações do mesmo extrato, parcialmente purificadas por cromatografia de exclusão molecular, usando Sephacryl S-100-HR, com atividade de inibidor de tripsina, foram testados sobre o crescimento dos fungos. Os fungos foram cultivados em placas de Petri (5 cm de diâmetro), contendo 7 mL de meio BDA previamente adicionado de 0,21 e 47 µg de proteínas do extrato bruto ou de 0, 1, 3, 7, 15 e 20 µg de proteínas das frações. A concentração de proteínas foi estimada pelo método de Bradford, com albumina de soro bovino como padrão. As duas concentrações de proteínas do extrato bruto de sementes testadas e as concentrações superiores a 7 µg de proteína/placa das frações com atividade inibitória de tripsina apresentaram efeito fungistático sobre ambos os isolados de P. tinctorius, mas não alteraram o crescimento de R. solani. As proteínas da planta hospedeira com atividade de inibidor de tripsina apresentaram efeitos diferentes sobre o crescimento do fungo simbionte e do patogênico. Porém, a ausência de atividade de tripsina nos isolados de P. tinctorius e de R. solani, verificada através da incubação do meio de cultivo BD, onde cresceram previamente esses fungos, com o substrato BAPNA, não permitiu uma correlação direta da inibição do crescimento com a atividade do inibidor de tripsina de sementes.